Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

Prof. Dr. Abdulkerim BEDİR Ondokuz Mayıs Üniversitesi Samsun 2014.

Benzer bir sunumlar


... konulu sunumlar: "Prof. Dr. Abdulkerim BEDİR Ondokuz Mayıs Üniversitesi Samsun 2014."— Sunum transkripti:

1 Prof. Dr. Abdulkerim BEDİR Ondokuz Mayıs Üniversitesi Samsun 2014

2 Lab Döngüsü

3 Hasta Edinim/ Acquisition İşlem/ Proses SaklamaDağıtım Bilimsel Analiz Tıbbi/ Cerrahi Prosedürler Artanı Stoklama Biyospesmen and süreç Biyospesmen Bilgilerinin Derleme ve Analizi Klinik/Klinik Araştırma Çıktıları Bilimsel Bilgilerin Derleme ve Analizi

4 Moleküler Amaç Genomics Proteomics Metabolomics Yüksek kalitede Biyospesmenlere bağlıdır 1-Teşhis etmek 2-Tedavi belirlemek 3-Risk analizi

5 Moleküler İdeal BugünYarın

6 Moleküler Evren

7 Moleküler Doğma

8 Moleküler Akış

9 Preanalitik faktörler I: Sıvı Biyospesmen  Antikoagülanlar  Sitrat- DNA, RNA  EDTA- DNA  Heparin- Sitolojik testler  Stabilizör/İnhibitörler  Protein:  Proteaz inhibitörleri  RNA:  Beta-merkaptoetanol (stabilizör)  RNaz inhibitörleri  DNA:  Stabildir-Örn. Guthrie testi  Saklama sıcaklığı

10  Bekleme süresi  Hücre sayımı 24 saatte düşer  Sterilite  Bakteriyal kontaminasyon  Fungal kontaminasyon  Endojen bozucu etkenler  Enzimler: Proteazlar, DNazlar, RNazlar  Hücre ölümü  Numune tüpleri/kapları  DNaz-free  RNaz-free  Steril

11 Antikoagulanlar AditifRenkTestler YokKırmızıBiyokimya, Seroloji, immünoloji, serum Sodium heparin (freeze dried) YeşilImmünoloji, viroloji testleri Sodium heparinKahverengiSitogenetik testler, moleküler testler Tripotassium EDTA ( % solution) MorVirology, molecular biology Acid citrate dextrose (ACD) solution SarıMoleküler biyoloji

12 Preanalitik faktörler II: Solid Biyospesmen  Kanser hücrelerinde genomik değişiklikler düşük frekanstadır  Kantite sorunu  Biyopsi materyali  Kalite sorunu  Biyopsi materyalleri formalinle fiksedir.  DNA izolasyonu özel protokole tabidir  Pürite sorunu (Tümör heterogenitesi)  Normal hücreler ile karışıktır  Kanserin kendisinde heterogenite (farklı klonlar)

13  FFPE (formalin-fixed, paraffin-embedded) örnekler  Fiksasyon süresi  Parafine gömme sıcaklığı  Doku takip işlemi  Parafin blokları saklama şartları  DNA intak değildir  Kovalen addükler oluşur  PCR  300 bp fragman

14  Taze doku örnekleri  Patolog gözetiminde çalışılmalıdır  İnce iğne biyopsi materyalleri  Hücre sayısı yetersiz olabilir

15 Saklama koşulları- DNA  Numuneler  Kan, Kemik iliği, Vücut sıvıları  <1 gün, 23°C; 3 gün, 4°C  WBC, >1 year, -20°C or -70°C  Doku  <1 gün, 4°C  >2 hafta, -20°C  >2 yıl, -70°C  Izole DNA  <26 hafta, 2-25°C  1-3 yıl, 4°C (Southern blot için 1 yıl)  <7 yıl, -20°C, -70°C (not frost-free)

16 Saklama koşulları- RNA  Numuneler  Kan, Kemik iliği, vücut sıvıları  <2 saat, 23°C or 4°C  5 gün, 23°C; 7 gün 4°C denaturan’da  1-2 hafta, -70°C denaturan’da  WBC, 2-4 hafta, -20°C; >6 ay, -70°C  Doku  <2 saat, 4°C  snap frozen, -70°C, >2 yıl  nitrogen vapor -140°C– -150°C, >2 years  Izole RNA  <30 gün, -20°C DEPC-treated su içinde  <30 gün, -70°C DEPC-treated su içinde  >6 ay, -70°C ethanol içinde

17 Preanalitik faktörler III: Moleküler lab  Benç ve ekipmanlar  Fizik alan olarak ayrı bir laboratuvar olmalı  Tek-yönlü iş akışı olmalı  Laminer flow kabin kullanılmalı  Eldivensiz çalışılmamalı  Giriş-çıkışlar sınırlı olmalı  Ekipman ve malzemeler laboratuvara özel olmalı; asla dışarı çıkarılmamalı  DNaz-free ve RNaz-free çalışma ortamı sağlanmalı  RNase ZAP (yüzey dekontaminasyonu),  RNase AWAY (plastik ve cam malzemeler) gibi solüsyonlar kullanılabilir

18  Sarflar  Filtreli pipet ucu kullanılmalı  DNaz-free ve RNaz-free sertifikalı olmalı  Cam malzemeler 0.1% diethyl pyrocarbonate (DEPC) ile yıkanmalı  Reaktifler  Otoklav yetersizdir  Kimyasal ve sarflar, DNaz-free ve RNaz-free sertifikalı olmalı,  DEPC iyi bir RNaz inhibitörüdür  Su, reaktif ve solusyonlar mutlaka DEPC içermeli,  0.05–0.1% DEPC ilave edilebilir (Tris ve EDTA tamponlar hariç)

19  Reaksiyonlar  Cross-kontaminasyon önlenmeli  RNasin eklenmeli  Blank tüp/kuyu kullanılmalı  İnternal kontrol kullanılmalı  Mümkünse kapalı sistemler tercih edilmeli  Lab temizliği  Çalışma öncesi kabinlerde UV kullanılmalı  Her çalışmadan sonra dekontaminasyon yapılmalı  Yüzeyler önce %10 hipoklorit sonra %70 etanol ile  RNaz kontaminasyonu düzenli kontrol edilmeli  RNaseAlert kit  Wipe test

20 İş-akışı

21 Çözüm-Otomasyon  MagNA Pure (Roche)  Molecular Biology Workstation (Tecan)  BioRobot (Qiagen)  NucliSENS (BioMerieux)  Viper system (BD)

22 TECAN MagNA PureBioRobot NucliSENS

23 Viper

24 Platformlar-DNA  Ekstraksiyon/Pürifikasyon  Array-CGH  CGH  Dizi analizi  Elektroforez  FISH  In situ hibridizasyon  PCR/LCR/RT-PCR/RFLP  SNP assay  Doku mikroarray

25 Platformlar-RNA  Ekstraksiyon/Pürifikasyon  cDNA mikroarray  In situ hibridization  Elektroforez  Northern blot analizi  RT-PCR  Doku mikroarray

26 Platformlar-Protein  Ekstraksiyon/Pürifikasyon  1D/2D gel elektroforezleri  Antikor mikroarray  İmmunohistokimya  Kütle spektrometre  MALDI-TOF  SELDI-TOF  Doku mikroarray  Western blot analizi

27 Preanalitik faktörler IV: Edinim (Acquisition) ÖnceSonra Warm iskemiCold iskemi AntibiyotiklerOda ısısında kalma süresi Diğer ilaçlarOdanın sıcaklığı Anestezi tipiFiksatif tipi Anestezinin süresiFiksatifin sıcaklığı Turnike zamanıFiksatifte kalma süresi Kan basınç değişimleriDondurma yöntemi Intra-Op kan kaybıDondurmanın hızı Intra-Op kan verilmesiAlikotlama volümü Intra-Op sıvı verilmesiÖrnek kabının tipi Cerrahi/Tıbbi tedavi tipiEkstraksiyon yöntemi Varolan rahatsızlıklarıSaklama sıcaklığı ve süresi Hastanın cinsi (K/E)Vakumlu saklama

28 Edinim (Acquisition) Warm iskemi (Intra-op) Cold iskemi (Post-op)

29 Background Cold iskemiWarm iskemi

30 Background

31 Standardization and Improvement of Generic Pre-analytical Tools and Procedures for In Vitro Diagnostics

32

33

34

35

36 Sistematik- SPREC-01 Standard Preanalytical Coding for Biospecimens Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention 2010;19:

37 Örnekler Sıvı spesmenSerumPlazmaİdrarSSS Sample typeSERPL2U24CSF Type of containerSSTSEDPIXPPT Precentrifugation delayABBB CentrifugationEBAC Second centrifugationNENN Postcentrifugation delayAAAA StorageGGJA

38 Solid spesmenSolid doku Sample typeTIS Type of collectionBPS Warm ischemiaN Cold ischemiaB Fixation typeRNL Fixation timeA StorageA

39

40 FFPE ve saklama koşulları J Histochem Cytochem April; 59(4): 356–365.

41 Contribution of WIMA and WIRD to changes in gene expression within different time periods. Yi Ma, et al., Analytical Biochemistry Volume 423, Issue Warm iskemi ve gen ekspresyonu

42 Cold iskemi ve gen ekspresyonu Sprüssel et al, BioTechniques 2004 Genlerin yaklaşık % 20-25’i ilk 30 dakikada etkilenmiştir (Affymetrix cDNA microarray)

43 Cold iskemi ve protein ekspresyonu Proteinlerin yaklaşık %25-30’u ilk 30 dakikada etkilenmiştir (SELDI-TOF)

44 Cold iskemi ve IHC/FISH sonuçları

45 Biyopsi lokasyonu ve kolon kanserde protein ekspresyonu  Proteinlerin yaklaşık %40’ı tümör bölgesine göre değişim göstermiştir

46 Biyopsi lokasyonu ve kolon kanserde VEGF ekspresyonu

47 Sonuç ve Öneriler  Sorumluluk tamamen klinisyenlere bırakılamaz;  Sorumluluk büyük oranda laboratuvar uzmanına aittir;  Laboratuvar uzmanı, klinisyenleri doğru yönlendirmeli,  Sürekli gelişim esas olmalı,

48  Klavuzlar takip edilmeli ve uygulanmalı,  Literatür takip edilmeli,  Kalite kontrol sistemleri uygulanmalı,  Preanalitik hatalar yanlış teşhis, tedavi ve öngörüye yol açar,  Sonuçta hastanın yaşam kalitesini olumsuz etkiler,  Biospesmen bilimi’nin varlıgını kabul etmeliyiz

49 Teşekkürler

50 Kılavuzlar (CLSI)

51

52


"Prof. Dr. Abdulkerim BEDİR Ondokuz Mayıs Üniversitesi Samsun 2014." indir ppt

Benzer bir sunumlar


Google Reklamları