GRAM POZİTİF, SPORSUZ, ANAEROB BASİLLER Prof. Dr. Mehmet KIYAN

Anaerop, sporsuz, gram pozitif basil ve koklar İnsanların normal deri ve mukoza florasında bulunurlar. Fırsatçı patojen bakterilerdir. Özellikle ağız ve ürogenital bölgelerden alınan klinik örneklerde, flora üyesi olarak sıkça üretilirler. Yara ve abse örneklerinden yapılan kültürlerde, genellikle diğer bakterilerle birlikte izole edilirken, steril vücut bölgelerinden alınan örneklerde nadiren, saf kültür şeklinde üretilebilirler.

Gözle görülebilir koloni oluşturma süresi Bacteroides fragilis ve Clostridium perfringens’e göre daha yavaş ürerler. Bacteroides türleri için 48 saatlik bir inkübasyon genellikle yeterli iken bu grup bakterilerde süre daha uzundur. 3-5 günlük inkübasyon gerekebilir. Bu süre Actinomycosis olgularında iki haftanın üzerine çıkabilir. Boyun abseleri, amnion sıvısı gibi örnekler katı veya sıvı besiyerlerine ekildikten sonra iki gün veya daha kısa süre bekletilecek olursa, sıklıkla, “üreme görülmedi” diye rapor edilir.

Gözle görülebilir koloni oluşturma süresi Zorunlu anaerop türler, oksijene karşı aşırı duyarlı olduğundan, anaerop nakil ortamlarında bile dört saat içinde hayatiyetlerini kaybederler. Bu nedenle zorunlu olmadıkça, anaerop nakil araçları kullanılmamalı, eğer kullanma zorunluluğu varsa, en kısa sürede laboratuvara ulaştırılıp, derhal ekimlerin yapılması sağlanmalıdır.

Taksonomi Bu nedenle anaerop, gram pozitif sporsuz basiller ile koklar mikrobiyoloji laboratuvarlarında hataların, en çok yapıldığı bakteri grubunu oluşturmaktadır. Bu bakteri grubunun taksonomisi henüz tam olarak yapılabilmiş değildir. İlk izolasyonlarındaki güçlükler yanında, cins düzeyindeki tanımlamalarda da zorluklar ile karşılaşılmakta, ancak tür düzeyindeki isimlendirme, nispeten, daha kolay yapılabilmektedir.

Anaerop, gram pozitif, sporsuz bakteriler DNA’larında bulunan G+C miktarına göre 1) Düşük miktarda G+C içerenler: Lactobacillus, Eubacterium, Peptostreptococcus Peptococcus 2) Yüksek miktarda G+C içerenler: Bifidobacterium, Propionibacterium, Actinomyces, Mobiluncus, Rothia

ANAEROP GRAM POZİTİF SPORSUZ BASİLLER Bu grup içinde: Actinomyces, Bifidobacterium, Lactobacillus, Mobiluncus, Propionibacterium, Eubacterium Rothia cinsleri bulunur. Ağız boşluğu, bağırsak ve ürogenital sistem gibi mukoza ile kaplı yüzeylerde ve deride sık bulunurlar.

ANAEROP GRAM POZİTİF SPORSUZ BASİLLER Propionibacterium acnes’in folikül dibinde oluşturduğu propionik asit irritasyonu komedon teşkiline neden olurken; Eubacterium türleri periodental hastalıklarla ilgili bulunmuştur. Geçmişte birçok tür normal flora üyesi olarak kabul edilmişse de son yıllarda yapılan çalışmalar, bazılarının, hastalıklarla ilgili olduğunu ortaya koymuştur.

ANAEROP GRAM POZİTİF SPORSUZ BASİLLER Hücresel morfolojileri bakımından pleomorfizm gösterirler. Sıklıkla gram pozitif olmakla birlikte bazen aynı preperatta gram değişken boyanma özelliği de gösterirler. zorunlu anaerop olanlar Bifidobacterium, Eubacterium Mobiluncus Diğerleri fakültatif anaerop, mikroaerofil ve/veya kapnofiliktir. Katı besiyerlerinde gözle görülebilen koloni oluşturabilmeleri için, çoğu üç gün veya daha uzun süreye gereksinim gösterir. Bu süre bazı türlerde iki haftanın üstüne çıkabilmektedir. Actinomyces israelli

ANAEROP GRAM POZİTİF SPORSUZ BASİLLER Direkt mikroskobik inceleme, bu grupte yer alan basillerin saptanmasında mutlaka yapılması gereken ve çoğu zaman yol gösterici bir yöntemdir. Bu grup bakteriler, içinde vankomisin bulunmayan, hemin ve vitamin K eklenmiş % 5 koyun veya tavşan kanlı agar besiyerinde üretilebiir. İlk izolasyonda taze besiyerleri (1 haftadan az) tercih edilmeli, Ekim yapılmış plaklar derhal anaerop ortama konmalı ve en az 5 gün 35°-37°C’de inkübe edilmelidir. Hücresel ve koloni morfolojilerinin; besiyerinin özellikleri (katı-sıvı), kültür koşulları ve yaşına göre değişebileceği akılda tutulmalıdır.

Anaerop, gram pozitif, sporsuz basillerin ilk izolasyonlarında tercih edilen besiyerleri CDC anaerop kanlı agar Anaerop kan kültür besiyeri Beyin-kalp infüzyon agar Tiyoglukolat besiyeri Kıymalı-glikozlu besiyeri Brucella kanlı agar Modifiye Schaedler agar Kalp infüzyon agar

Anaerop, gram pozitif, sporsuz basillerin metabolik son ürünlerine göre ayrımı. I) Fazla miktarda propionik asit ve asetik asit oluşturanlar A- Katalaz pozitif Propionibacterium B- Katalaz negatif Arachnia II. Propionik asit oluşturmayanlar A- Asetik ve laktik asit oluşturan (Aa > La) Bifidobacterium B- Çok miktarda laktik asit oluşturan Lactobacillus C- Asetik asit ve suksinik asit oluşturan Actinomyces, Mobiluncus D- Butirik asit oluşturanlar Eubacterium

LACTOBACILLUS

LACTOBACILLUS Lactobacillaceae ailesi için yer alırlar. Lactobacillus cinsi, metabolik son ürünlerine göre tanımlanmakta ve buna göre iki gruba ayrılmaktadır. 1) Homofermentatif olanlar glikozdan major fermentasyon ürünü olarak laktik asit meydana getirir 2) Heterofermentatif olanlar, yarısı laktik asit olmak üzere değişik miktarlarda asetik asit ve etil alkol oluşturmaktadır.

LACTOBACILLUS Basillerin bir kısmı uzun ve ince, silindir şeklinde, bir kısmı ise tombul ve kısa görünüme sahiptir. Uzun olanlar tek tek yada birbirine paralel dizilmiş bahçe çitini andırır görünümdedir Kısa olanlar kokobasile benzer ve sıklıkla zincir oluştururlar.

LACTOBACILLUS Kültürden yapılan boyamalarda diplobasil ve böbrek şeklinde görülebilmektedir. Bazen streptokoklar ile karıştırılabilirler. Bu durumda tiyoglukolat besiyeri iki cinsin ayırımında yardımcı olabilir. Bu besiyerinde streptokoklar uzun, Lactobacillus kısa zincirler yapar Çoğu hareketsizdir.

LACTOBACILLUS İlk izolasyonlarında mikroaerofilik veya anaerop ortama gereksinim duyarlarsa da sonraki pasajlarda aerobik özellik kazanabilirler. Çoğu suş adi besiyerlerinde üremez. Kolay ürediği besiyerleri Kanlı agar Çikolatamsı agar Rogosa’nın domates sulu agar by Asit pH’ya sahip Seçici besiyeri

LACTOBACILLUS Kesilmiş süt suyu ve glikoz üremeyi arttırır. Bazı türler çeşitli vitaminlere ihtiyaç duyar. 5°-53°C’ler arasında çoğalabilir. Optimal ısı 37°C, pH 6 Bakterilerin ayırdedici özellikleri gram boyamadaki tipik morfolojileri, katalaz testinin negatif oluşu, gaz kromatgorafisinde yüksek oranda laktik asit saptanması Çoğu durumda Lactobacillus’ların tür düzeyinde identifikasyonu gerekmez

LACTOBACILLUS Doğada yaygındırlar İnsan ağız boşluğu, gastrointestinal ve ürogenital sistem florasında bulunurlar. Yenidoğanlar ve puberteden menapoza kadar olan dönemdeki erişkin kadınların vajen florasında predominant olarak bulunurlar ve Doderlein basilleri olarak anılırlar. L. acidophilus, L. casei, L. fermenti, L. cellobiosus Leuconostoc mesenteroides, Bu bakteriler vajina epitelindeki glikojenden laktik asit oluşturarak pH’ı 3-4’e kadar düşürüp patojen mikroorganizmaların vajinaya yerleşmesine engel olurlar.

LACTOBACILLUS insan ağız boşluğundan sıkça izole edilen türler L. casei, L. salivarus, L. gasseri L. crispatus Özellikle, anne sütü ile beslenen yenidoğanların bağırsak florasında yer alırlar. Lactobacillus’lar nadir olarak : neonatal menenjit Korioamnionit Amnionit plöropulmoner infeksiyonlar endokardit bakteriyemi olgularından izole edilebilir. Diş çürümelerinde rollerinin olduğu düşünülmektedir. Çoğu tür belirgin olarak minimal düzeyde potansiyel patojen iken; L. catenaforme, plöropulmoner infeksiyonlar ile ilişkili bulunmuştur.

MOBILUNCUS

MOBILUNCUS Zorunlu anaerop, çok sayıdaki subpolar kirpikleriyle hareketli, uçlara doğru incelen, kıvrık çomak şeklindeki bir bakteridir. Başlangıçta Bacteroidaceae ailesine dahil edilen mikroorganizma son yıllarda yapılan 16 sRNA parsiyel reverse transcriptase sekans analizleri sonucunda Actinomycetales’ler ailesi içine konmuştur. Hücre duvar yapısı, gram pozitif bakterilerde olduğu gibidir. Ancak çoğu zaman gram negatif boyanırlar.

MOBILUNCUS Bazen tek tek, bazen zincir oluşturabilirler. Genusta tanımlanan iki tür bulunur: M. curtisii M. mulieris. Üretilmeleri güçtür. Nemli ortamda, taze hazırlanmış % 5 koyun kanlı agar besiyerinde, anaerop şartlarda, başlangıçta 1 mm çaplı olan kolonileri, beşinci günden sonra en fazla 2-3 mm’ye ulaşır. Koloniler renksiz, yarı şeffaf, konveks ve düzgün kenarlıdır.

MOBILUNCUS Normal vajen florası üyesidir. İnsan rektumundan da sıkça, üretilmektedir. Lactobacillus’ların predominant olduğu sağlıklı kadınların vajinal sürüntü örneklerinde % 10’un altında izole edilirken, nonspesifik bakteriyel vajinitli kadınlardan alınan örneklerin % 50-65’inde Mobiluncus türleri de üretilmektedir. Gardnerella vaginalis ile birlikte Bakteriyel vajinitli olgularda etken olarak karşımıza çıkar

MOBILUNCUS Tipik “clue cell” görünümüne neden olan G. vaginalis ile birlikte vagen epitel hücrelerini attake ettiği ortaya konulmuştur. Pelvik iltihabı hastalığı olan kadınların endometrial aspiratlarından ve erken doğan bebeklerin plesentalarında sıklıkla Bacteroides ve Peptococcus türleri ile birlikte izole edilirler. Steril vücut bölgelerinden alınan örneklerde nadiren saf kültür şeklinde de üretilebilmektedir.

Gardnerella

Gardnerella İlk olarak Haemophilus vaginalis Daha sonra Corynebacterium vaginalis 1955 yılında Gardnerella vaginalis ismi verilmiştir Hermann L. Gardner (1918 – 2005) Genusta yer alan tek tür G. vaginalis Gram pozitif hücre duvar yapısına sahip olup sıklıkla gram değişken boyanan Fakültatif anaerop Küçük -1.5 µm çapında Sporsuz Hareketsiz Kokobasil şeklinde Çukulata agar besiyerinde gri renkli, küçük, yuvarlak, konveks koloniler Selektif besiyerleri HBT (Human Blood Tween) (içinde Safra tuzu, Colistin, Nalidiksik asit, Amfoterisin B bulunur) Colistin-oxolinic asit kanlı agar

BAKTERİYEL VAGİNOZİS Vajinit vakalarının %45’inden sorumludur Obstetrik hastalarının % 20-30’unda mevcuttur Vakaların yaklaşık yarısı asemptomatiktir Sıklıkla polimikrobiyaldir. En sık etken Gardnerella vaginalis’tir Laktobasillerin azalıp yerini Gardnerella vaginalis, Mobiluncus, Bacteriodes Peptococcus ve Peptostreptococcus gibi anaerob bakterilerin aldığı polimikrobiyal bir sendromdur İnflamasyon yoktur Cinsel aktivite ile ilişkilidir ancak CYBİ değildir 28

BAKTERİYEL VAGİNOSİS Predispozan faktörler Esas semptom; koku : Vajinal duş RIA kullanımı Yeni cinsel eş Vajinal enstruman kullanımı Sigara kullanımı Esas semptom; koku : özellikle koitus sonrası ve akıntı mevcutken balık kokusu Homojen, köpüklü, gri beyaz renkli vagina duvarlarını ince bir tabaka halinde örten sekresyonlar PH > 4.5 ( 5.0-5.5 ) Serum fizyolojik ile hazırlanan taze preparatta CLUE HÜCRELERİN varlığı Whiff testi veya Amin koku testi : vaginal sekresyona KOH eklenmesiyle kokmuş balık veya amin kokusu

Bakteriyel vajinozis Gebelikte erken doğum, korioamnionit, endometrit riskini artırır Daha önce erken doğum yapmış, erken doğum riski yüksek hastalarda BV tedavisi desteklenmektedir 30

Gardnerella vaginalis vajinitinde tanı Vajinal akıntıdan hazırlanan smearların Gram boyalı preperatlarında; a) "Clue cell” varlığı: Dökülen vajen epitel hücresinin gram değişken kokobasiller ile örtülmüş olarak adeta bu hücrelerde bakteriler yapışmış gibi görülmesi "CLUE cells=ipucu (Yumak) hücre” olarak da tanımlanır b) Gram variabl kokobasillerin görülmesi c) Laktobasillerin azalması veya kaybolması d) Lökosit sayısının azalması

PROPIONIBACTERIUM

PROPIONIBACTERIUM Önceden anaerop Corynebacterium’lar cinsinin üyesi iken Actinomyces’lere olan yakın benzerlikleri ve bol miktarda propionik asit oluşturmaları nedeniyle, ayrı bir cins içine alınmışlardır. Dallanma özelliğine sahip, hareketsiz, sporsuz difteroid görünümlü basillerdir. X, Y, V harflerine benzer duruş şekilleri gösterirler. Bazen çok uzun olabilirler. Pleomorfik bakterilerdir.

PROPIONIBACTERIUM Anaerop ve mikroaerofil şartlarda, nonselektif besiyerlerinin çoğunda, rahatlıkla ürerler. Katalaz aktivitesine sahiptirler. İndol pozitiftirler.

PROPIONIBACTERIUM İnsan hastalıkları ile ilgili en önemli türler P. acnes, P. granulesum, P. avidum ve P. lymphohylum’dur. P. acnes ve P. granulosum, follikül dibinde meydana getirdikleri propionik asidin yaptığı irritasyon sonucu, akne oluşumuna neden olur. P. acnes, prostetik kapak endokarditli ve damar grefti konulan hasta kanlarından; P. avidum, irin, beyin ve çene abselerinden; P. lymphophylum, Hodgkin lenfomalı olguların lenf düğümlerinden izole edilmiştir.

EUBACTERIUM

EUBACTERIUM Zorunlu anaerop, Kapsülsüz, Kemoorganotrop Çoğu hareketsiz Düzensiz çomak biçiminde Bazı suşlar çomakcık, bazıları kokoidal formda Zincir oluşturabilirler. Bu görünümleri ile boyalı preparatlarda streptokok ve laktobasiller ile karıştırılırlar. Dallanmış, filamentöz morfolojiye sahip türleri de vardır. Tek tek, çiftli veya kümeler halinde görülebilirler.

EUBACTERIUM E. lentum Diğer bakteriler (B. fragilis) ile birlikte, gerek hücresel, gerekse koloni morfolojisi bakımından Actinomycesler’e çok benzemekte ve tıpkı onlar gibi rahim içi araç kullanan kadınların üst ve alt genital bölgelerinden yapılan kültürlerde üreyebilmektedir. Diğer bakteriler (B. fragilis) ile birlikte, yara abse. E. alactolyticum, E. nodatum, E. timidum ve E. branchy periodental hastalıklarla ilişkili Beyin abseleri, postoperatif yaralar, Akciğer infeksiyonları baş, çene ve boyun bölgelerindeki infeksiyonlar

BİFİDOBACTERIUM

BİFİDOBACTERIUM Uçları sivri veya topuz şeklinde şişlikler gösteren, nispeten uzun, ince polimorfik basillerdir. Bazı türler dallanma, çatallanma gösteren flamentöz yapılar oluşturabilir.

BİFİDOBACTERIUM Tiyoglukolatlı besiyerlerinde diffuz üreme gösterir. Katı besiyerlerinde, parlak, beyaz, konveks ve kenarları düzensiz koloniler meydana getirir. Metabolik son ürünleri asetik asit ile laktik asittir. Ancak asetik asit miktarı daha fazla olup, oran yaklaşık 3:2’dir.

BİFİDOBACTERIUM Nitratı indirgemez, Jelatini parçalamaz ancak eskulini hidrolize ederler. Glikozu gaz oluşturmadan, bol asit yaparak parçalarlar. Karbonhidratlara olan etkilerindeki farklılıklar, tür düzeyindeki ayrımda yardımcı olur

BİFİDOBACTERIUM Anne sütü ile beslenen çocukların bağırsak florasının % 90’ını oluştururlar. Yetişkinlerin ağız boşluğu, vajen ve dışkısından da izole edilebilir. Bazı türleri, diğer bakterilerle birlikte ciddi olabilen alt solunum yolu infeksiyonlarına neden olabilir. Literatürde seyrek olarak B. longum ve B. breve ile oluşmuş infeksiyonlarda bulunmaktadır. Önceden Actinomyces eriksonii, sonra, Bifidobacterium eriksonii olarak isimlendirilen türe günümüzde, Bifidobacterium dentium denmektedir. Bu bakteri Bifidobacterium cinsi içinde potansiyel patojen olan tek türdür.

ROTHIA

ROTHIA Bu cins içinde Rothia dentocariosa denilen tek bir tür bulunur. Koloni ve hücre morfolojisi bakımından Actinomyces ve Nocardia türleri ile büyük benzerliklere sahiptir. Fermentatif olmaları ile Nocardia’lardan ayrılır. Hareketsiz, Katalaz pozitif Eskulini hidrolize eder. Ureaz aktivitesi yoktur, nitratı indirgemez. Glukoz, maltoz, sükrozdan asit oluştururken; Mannoz, ksiloz ve laktoza etkisizdir. Anaerop ortamda oluşturduğu koloniler, örümcek ağı şeklinde oldukça filamentöz görünümlü ve R tipinde olup Actinomyces kolonilerine benzer. Aerobik şartlarda 18-24 saatte 1 mm çaplı düzgün veya granüler görünümlü olan koloniler, 3-7 gün sonra basıklaşır ve S tipi koloni haline gelir.

ARACHNIA

ARACHNIA Gerek Arachnia gerekse Rothia’ların sınıflandırma çalışmaları, halen devam etmektedir. P. propionicus, aktinomikoz ve lakrimal kanalikulitli olgulardan izole edilmiştir. Hayvanlarda abse oluşumuna sebep olurlar. Bu cins içinde A. propionica denilen tek bir tür bulunur. Son yıllarda yapılan çalışmalar bu mikroorganizma ile Propionibacterium türleri arasında büyük benzerlikler olduğunu göstermiş ve bakteri Propionibacterium propionicus olarak yeniden isimlendirilmiştir. Fenotipik özellikleri bakımından Propionibacterium’lardan çok, Actinomyces’lere benzemektedir.