Ekstraselüler DNA’nın (eDNA) Biyofilm Yapısındaki Rolü

... konulu sunumlar: "Ekstraselüler DNA’nın (eDNA) Biyofilm Yapısındaki Rolü"— Sunum transkripti:

1 Ekstraselüler DNA’nın (eDNA) Biyofilm Yapısındaki Rolü

2 eDNA’nın Kökeni P. aeruginosa biyofilmlerinde eDNA’nın miktar olarak proteinlerden altı kat, karbonhidratlardan on sekiz kat daha fazla olduğu belirlenmiştir. Özetle eDNA EPS yapısında oldukça fazla bulunan bir matriks elemanıdır. Araştırmacılar uzun bir süre eDNA’nın genomik DNA’dan mı yoksa plazmit DNA’sından mı oluştuğunu tartışmıştır. eDNA’nın kaynağı ile ilgili akla gelen bir diğer ihtimal ise eDNA’nın hücreler tarafından özel olarak sentezlenen bir polimer olduğu yönündeydi. Çeşitli araştırmalar sonucunda eDNA’nın genomik DNA (gDNA) ile benzerlik gösterdiği tespit edilmiştir.

3 eDNA’nın Kökeni (devam)
Steinberger ve Holden’in çalışmasında (2005) P. aeruginosa biyofilmlerinde yapılan “Rastgele Polimorfik DNA Amplifikasyon” (RAPD) denemeleri, eDNA’nın gDNA ile özdeş olduğunu kanıtlar niteliktedir. Bir başka araştırma grubu tarafından yine P. aeruginosa’da yapılan Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ve Southern analizleri sonucunda eDNA ve gDNA arasındaki benzerlik bir kez daha gösterilmiştir. Listeria monocytogens ile yürütülen PCR çalışmaları, incelenen eDNA’nın kromozomal kökenli olduğunu kanıtlamıştır. Özetle, farklı araştırmacılar tarafından, farklı bakteri biyofilmleri ile yürütülen çalışmalar, eDNA’nın gDNA kökenli olduğunu kanıtlar niteliktedir.

4 eDNA Salımı Hücre dışı DNA’nın biyofilm matriksindeki varlığı bilinse de, Whitchurch vd. (2002) tarafından yapılan çalışmada hücre dışı DNA’nın biyofilm matriksinde sadece bulunmakla kalmayıp önemli bir role sahip olduğunu da göstermiştir. Yapılan çalışmada biyofilm araştırmalarında model organizma olan P. aeruginosa biyofilmleri yeşil floresan boya ile boyanmış, ardından DNaz I eklenmiş ve eklenmemiş örnekler karşılaştırılmıştır. DNaz I enziminin uygulanması sonucunda, biyofilm yapısını zayıfladığı ve daha çözülebilir bir hale geldiği gösterilmiştir. Ardından, deoksiribonükleazların biyofilm yapısına olan etkisinin biyofilm oluşumunun hangi aşamasında en yüksek düzeye ulaştığını belirlemek amacıyla 12, 36, 60 ve 84 saat inkübasyona bırakılan örneklere farklı zamanlarda eklenmiş DNaz I enziminin etkileri incelenmiştir.

5 eDNA Salımı (devam) Yapılan çalışmada 12, 36 ve 60 saatlik inkübasyona bırakılmış örneklere belirli aralıklar eklenmiş DNaz I sayesinde biyofilm yapısı zayıflatılmış ancak 84 saatlik olgun biyofilmde DNaz I uygulamasının neredeyse hiç etki göstermediği kanıtlanmıştır. Bu çalışmanın sonucunda, biyofilm yapısındaki eDNA’nın fonksiyonel ve yapısal özellikleri araştırmacılar tarafından merak edilmeye başlanmış ve hücre dışı DNA bakteriyel biyofilmler için güncel araştırma konularından biri haline gelmiştir.

6 Gram Negatif Bakterilerde eDNA Salımı
Daha öncede belirtiğimiz gibi QS mekanizmaları profajların üretimini ve hücre lizisinde yer alan proteinlerin ve büyük miktarlarda eDNA’nın salımını kontrol eder. Gram negatif bakterilerdeki QS sinyal molekülleri olan açillenmiş homoserin laktonlar (AHL) ve Pseudomonas kinolon sinyal molekülü (PQS), profaj ve fenazin gibi hücre lizis faktörlerinin salımını kontrol ederler. Bu faktörler de hücre lizisini arttırarak eDNA salımını tetikler. Örnek olarak, P. aeruginosa pqsA ve lasI/rhlI mutantlarında eDNA salımının azaldığı görülmektedir. Çünkü mutant hücrelerde PQS ve AHL üretim eksikliği meydana gelir ve bağlantılı olarak profaj ve hücre- membran veziküllerinde azalma, dolayısıyla düşük miktarda eDNA salımı gerçekleşir.

7 Gram Negatif Bakterilerde eDNA Salımı (devam)
Gram negatif bakterilerde bulunan fenazin molekülü doğrudan veya dolaylı olarak moleküler oksijenin azalması ve hidrojen peroksit gibi radikallerin artmasına sebep olur. Bu durum hücre membranına zarar vererek kromozomal DNA’nın eDNA olarak çevreye bırakılmasına yol açar. Farklı suşlarda gözlenen fenazin eksikliği düşük miktarlarda H2O2 üretimine bağlı olarak hücre lizisini ve dolayısıyla eDNA salımını azaltır.

8 Gram Pozitif Bakterilerde eDNA Salımı
Gram pozitif bakterilerde eDNA salımı QS-bağımlı otolizinler aracılığıyla hücrelerin lize olması sonucunda gerçekleşir. AtlE, Staphylococcus epidermidis’in hücre duvarı yüzeyinde bulunan ve hücre lizisinde görev alan, atlE geninden kodlanan bir otolizin faktörüdür. Staphylococcus epidermidis 1457 ΔatlE gibi mutant suşlarda otolizin faktörünün eksikliği hücre lizisinden kaynaklı eDNA salımında %90 oranında azalmaya yol açar. Bir başka araştırmada Enterococcus faecalis’de QS-bağımlı mekanizmalara benzer yollarla eDNA salımı gerçekleştiği gösterilmiştir. Bu mikroorganizmada peptit lakton, jelatinaz ve serin proteaz adı verilen proteazların salımını arttırmasıyla, eDNA salımı dolaylı olarak artar.

9 Gram Pozitif Bakterilerde eDNA Salımı
Streptococcus intermedius ve S. mutans gibi oral bakteriyel suşlar yetkinlik-uyarıcı peptit (Competence Stimulating Peptide; CSP) denilen bir peptit sentezleyerek QS molekülleri aracılığıyla çevreden DNA alımı yapabilmek gibi çeşitli yollar geliştirmişlerdir. CSP molekülleri DNA’ya bağlanma ve DNA’yı hücre içine almada görev yaptıkları gibi, otolizinler aracılıyla hücre lizisini arttırarak eDNA salımını da kontrol eder. Ancak Streptococcus pneumoniae ve Streptococcus sanguinis gibi suşlarda eDNA salımı otolizinler aracılığıyla değil hidrojen peroksit veya bakteriyofajlar aracılığıyla gerçekleşir.

10 Gram Pozitif Bakterilerde eDNA Salımı (devam)
Gram pozitif bakterilerde eDNA salımı QS-bağımlı otolizinler aracılığıyla hücrelerin lize olması sonucunda gerçekleşir. AtlE, Staphylococcus epidermidis’in hücre duvarı yüzeyinde bulunan ve hücre lizisinde görev alan, atlE geninden kodlanan bir otolizin faktörüdür. Staphylococcus epidermidis 1457 ΔatlE gibi mutant suşlarda otolizin faktörünün eksikliği hücre lizisinden kaynaklı eDNA salımında %90 oranında azalmaya yol açar. Bir başka araştırmada Enterococcus faecalis’de QS-bağımlı mekanizmalara benzer yollarla eDNA salımı gerçekleştiği gösterilmiştir. Bu mikroorganizmada peptit lakton, jelatinaz ve serin proteaz adı verilen proteazların salımını arttırmasıyla, eDNA salımı dolaylı olarak artar.