İzlence son hali

Pratik Laboratuvarına  föyünüz  önlüğünüz  lab defteriniz ile gelmeyi UNUTMAYIN !

İmmuno (Vestern Blotlama) ve Moleküler Teknikler Mikrobiyoloji dersi-3 İmmuno (Vestern Blotlama) ve Moleküler Teknikler 2016-2017, Bahar, Trakya Üniv Tıp Fak 6. Kurul, 23.03.2017 Neşe Akış, PhD, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı akisn@trakya.edu.tr http://personel.trakya.edu.tr/akisn/#.WKr6DyjC7WU

Poliklonal-Monoklonal Antikor 1 Poliklonal-Monoklonal Antikor

Hibridoma teknolojisi ile her bir klon ve antikoru izole edilebilir

2 Vestern Blotlama (Western Blotting)

Vestern Blotlama Testinde Amaç ve Prosedür Bir katı faz seroloji yöntemidir. Tıbbi mikrobiyolojide genellikle hasta serumunda ELISA ile saptanan özgül antikor varlığını epitop düzeyinde doğrulamak için kullanılır (anti-HIV antikorun varlığını doğrulamak gibi..) Parmak genişliğinde kağıt gibi ince polimer tabakalar katı faz olarak kullanılır. Hücreden elde edilen ve her biri farklı epitop içeren antijenler tabakaya aralıklarla bağlanır ve üzerinde ELISA işlemi uygulanır. Her biri farklı epitop içeren antijenleri tabakaya aralıklarla dizmenin yolu antijen karışımını jel üzerinde elektroforezle boy sırasına dizmektir. Böylece büyükten küçüğe dizilen antijenler kolaylıkla jelden tabakaya aktarılabilir.

Antijenlerin Sıraya Dizilmesi ve Tabakaya Aktarılması Antijen karışımı çukura doldurulur 1 Jel çukur 2 Anotdan jele elektrik akımı uygulanır 3 Antijenler akım boyunca büyükten küçüğe sırayla jele dizilir 4 Sıralı antijenler jelden tabakaya nakledilir (üstüste koyarak)

Polimeraz Zincir Reaksiyonu 3 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)

PZR Testinde Amaç Varlığı DNA’da (genom veya parçası) sorgulanmak istenen bir dizinin (gen, provirüs, mutasyon) aranması testlerinden biri PZR’dir. Aramanın esasını varsa DNA’daki ilgili dizinin gözle görülebilecek sayıya suni olarak çoğaltılabileceği beklentisi oluşturur. Test en fazla 1000 nükleotidlik kısmı saptayabildiğinden sorgulanmak istenen dizinin genellikle kısa bir parçası tüpte çoğaltılarak aranır. Önce çoğaltma yapılır, sonra tüpteki karışım içinde aranan boyutta parça var mı incelenir. Varsa, dizinin tamamının DNA’da var olduğu düşünülür.

PZR Testinde Prosedür 25-40 döngüden oluşan çoğaltma işleminin her döngüsü; sorgulanan çift iplikli (çi) parçanın varsa her 3’ ucuna eşlenik tasarlanan primerlerin yapışmasıyla reaksiyon başlatılır. Tüpteki polimeraz eşlenmiş primerleri gördüğünde eşleneği sentezleyerek ilk döngüyü tamamlar. Sayı, 2 uzun DNA’dan 4 uzun DNA’ya çıkar. Reaksiyonun ikinci ve sonraki döngülerinin aynı biçimde tekrarlaması sağlanır. İlk parçasal çiDNA 3’ncü döngüde 4 adet olarak elde edilir. 25’inci döngüde parçasal çiDNA sayısı 33 milyon 550 bine çıkar. Böylece görülebilir hale gelir.

PZR için dizinin parçasını belirleme, primer bağlanması ve polimerazın eşlenek sentezlemesi DNA Sorgulanmak istenen dizi Çoğaltmak için seçilen parça 1’inci döngünün başlangıcı Primer bağlanması Eşlenek sentezlenmesi

PZR’da döngüler Parçasal çiDNA’lar Birinci döngü İkinci döngü.. . devam Parçasal çiDNA’lar Birinci döngü İkinci döngü.. . Üçüncü döngü

4 Ters transkriptaz PZR (RT PCR)

TT PZR Testinde Amaç ve Prosedür Varlığı hücrede sorgulanmak istenen RNA dizisinin (mRNA, rRNA, miRNA, lncRNA) hücre lizatında aranması testlerinden biri TT PZR’dir. Aramanın esasında ilk basamağı, varsa ilgili RNA’nın 3’ eşlenik primer ve ters transkriptaz enzimi yardımıyla tek iplikli (ti) kopyasal DNA’ya (cDNA) çevrilmesi oluşturur. Sonra, cDNA’nın PZR testi ile çiDNA’ya çevrilmesi, çoğaltılması ve görüntülenmesi yapılır.

TT PZR için mRNA’ya primer bağlanması, cDNA sentezlemesi ve PZR’ye geçilmesi Ters transkriptaz cDNA’nın serbestleşmesi ……PZR çiDNA PZR devam …

5 Gerçek zamanlı PZR (real time PCR)

GZ PZR Uygulamasında Amaç ve Prosedür GZ PZR, PZR veya TT PZR testi ile aranan DNA veya RNA dizisinin hücredeki miktarını belirlemek için uygulanır. Belirleme işlemi, sadece çiDNA ile karşılaştığında aktiflenerek renk yayan bir maddenin PZR reaksiyon tüpüne eklenmesi ile yapılır. Hücrede aranan diziden tüpte ne kadar çok varsa her PZR döngüsünde o kadar daha çok çiDNA gelişir ve renklenme aynı oranda artar. Döngüler boyunca renklenmedeki artışlar takip edilerek PZR’ye başlamadan önce tüpte kaç adet DNA veya RNA vardı hesaplanabilir.

GZ PZR uygulamasında yaygın kullanılan renk yayıcılardan biri SYBR yeşilidir ve çiDNA’ya bağlanarak renk yayar Renklenme zayıf DNA Isıtılan çiDNA’dan tiDNA’lar serbestleşiyor PZR döngüsü başlıyor Renklenme iki katına artmış PZR döngüsü bitiyor

LABORATUVAR GÜVENLİĞİ KURALLARI 1 Avrupa bilim alanı içindeki fenni ve tıbbi laboratuvarlar kimyasal, fiziksel ve biyolojik güvenlik kurallarına tabidir. Laboratuvar yöneticisi kuralları uygulamak sorumluluğunda ve yetkisindendir. Çalışma esnasında ortaya çıkabilecek ve personel veya çevreye verilebilecek zararlar açısından laboratuvarlar 1 ile 4 arasında bir risk seviyesindedir. Risk seviye-1: Öğrenci labları; Risk seviye-2: Kan, kan ürünü ve patojenlerle çalışan tıbbi laboratuvarlar; Risk seviye-3: Salgın oluşturan etkenlerle çalışan laboratuvarlar; Risk seviye-4: Kitle imhasına yol açan etkenlerle çalışan laboratuvarlar. 3. ve 4. risk seviyesindeki çalışmalar kabin altında yapılır. Kan ile çalışabilmek için kan kaynaklı enfeksiyon ajanlarına karşı aşılanmak gerekir. Laboratuvar işlem ve bulgularının çalışan tarafından kaydedilmesi zorunludur ve gizlilik taşır. Laboratuvarda beyaz, önü kapalı, dize kadar uzanan önlük veya üst-alt takım lab kıyafeti giyilir, ekstremitelerin korunması gözetilir.

LABORATUVAR GÜVENLİĞİ KURALLARI 2 Lab önlüğü ile laboratuvar dışına çıkılmaz, yemekhaneye gidilmez, önlük çıkışta askıya asılır. Biyolojik materyal ile çalışırken eldiven, lab gözlüğü ve bone giyilmesi tercih edilir. Eldiven ile yüze, burna ve göze dokunulmaz. Kimyasallar, (a) uçucu ve yanıcılar, (b) asit ve bazlar, (c) karsinojen ve zehirliler, (d) diğerleri olarak sınıflanarak ve birbirinden izole edilerek depolanır. Radyoaktif maddelerle çalışmalar, sıvı kaynatma veya gazlı şişe kapağı açma gibi püskürme oluşturan uygulamalar kenarları kapalı çekerocak davlumbazı altında yapılır. Lens, makyaj malzemesi ve açık saça kimyasallar absorbe olur, bunlar labda kullanılmaz. Yiyecek, içecek, şeker tableti veya çiklet kontamine olabilir, bunlar labda depolanmaz. Laboratuvarda ağıza pipet veya benzeri sokulmaz, materyaller koklanmaz.

LABORATUVAR GÜVENLİĞİ KURALLARI 3 Herhangi bir bulaşıcı hastalık geçiren personel tam iyileşene kadar laboratuvarda bulunmaz. Laboratuvar atıkları evsel, radyoaktif, biyolojik, farklı kimyasal atıklar olarak ayrı çöp kovalarına toplanır ve ayrı imha edilir. Sivri, kesici, batıcı atıklar ve cam kırıkları özel sert ve kapaklı çöp kaplarına atılır ve ayrı toplanır. Laboratuvar tezgahı çalışanı tarafından temiz ve düzenli tutulur, temizlikte etil alkolün su içinde %70’lik eriyiği kullanılır. Radyoaktif madde, deney hayvanı veya insan ile ancak sertifikalı laboratuvarcı çalışabilir, ayrıca çalışama ilgili etik kurulca onaylanmalıdır. Radyoaktif maddelerle yapılan çalışmalar bittiğinde tezgah ve çevre özel temizleyicilerle ve Geiger sayacında sinyal kaybolana dek temizlenir. Atıklar kurşun kap veya kalkan arkasında depolanır. Beta emisyonu yapan ayıraçlar günde 50 miliküri seviyesinde lavaboya dökülebilir. Diğer atıklar ayda bir resmi toplayıcılar tarafından toplanarak 2 mt yeraltına gömülür.   Deney hayvanı çalışmaları deney hayvanlığındaki laboratuvar veya hayvan geri dönmeyecekse olağan laboratuvarda çeker ocak altında yapılır. Bir deney hayvanına eziyet edildiğini gören laboratuvarcı, aynı insan çalışmalarında olduğu gibi, durumu doğrudan en üst sorumluya bildirir. Hastadan alınan rutin tetkik materyalleri sonuçlar elde edildikten sonra tahrip edilir. Epidemiyolojik maksatlı toplu hasta sonucu isim gizlenerek epidemiyolojik maksatlı rapor edilebilir. İnsan vücuduna ait bir materyal veya bilginin tıbbi tanı ve tedavi dışında diğer kullanımı, üçüncü şahıs bir sağlık çalışanı bile olsa, ancak hasta rızası ile mümkün olur. Ayrıca, materyalin araştırma maksatlı kullanımı etik kurul izni gerektirir. Hastanın sağlık sigortası olanağı araştırma maksatlı harcanamaz. Laboratuvar ekibinin, bilim camiasının ve meslek örgütünün üyeleri birbirlerine karşı meslektaşlık saygı ve sorumluluğu gereği aralarında diğer bilgi ve materyalin paylaşımını yapar. Biyolojik materyal nakliyatı ilgili mevzuat ve kurallara göre yapılır.

LABORATUVAR GÜVENLİĞİ KURALLARI 4 Deney hayvanı çalışmaları deney hayvanlığındaki laboratuvar veya hayvan geri dönmeyecekse olağan laboratuvarda çeker ocak altında yapılır. Bir deney hayvanına eziyet edildiğini gören laboratuvarcı, aynı insan çalışmalarında olduğu gibi, durumu doğrudan en üst sorumluya bildirir. Hastadan alınan rutin tetkik materyalleri sonuçlar elde edildikten sonra tahrip edilir. Epidemiyolojik maksatlı toplu hasta sonucu isim gizlenerek epidemiyolojik maksatlı rapor edilebilir. İnsan vücuduna ait bir materyal veya bilginin tıbbi tanı ve tedavi dışında diğer kullanımı, üçüncü şahıs bir sağlık çalışanı bile olsa, ancak hasta rızası ile mümkün olur. Ayrıca, materyalin araştırma maksatlı kullanımı etik kurul izni gerektirir. Hastanın sağlık sigortası olanağı araştırma maksatlı harcanamaz. Laboratuvar ekibinin, bilim camiasının ve meslek örgütünün üyeleri birbirlerine karşı meslektaşlık saygı ve sorumluluğu gereği aralarında diğer bilgi ve materyalin paylaşımını yapar. Biyolojik materyal nakliyatı ilgili mevzuat ve kurallara göre yapılır.