PROTEİN SAFLAŞTIRMA TEKNİKLERİ SOUTHERN BLOT TURGUT ZENGİN.

... konulu sunumlar: "PROTEİN SAFLAŞTIRMA TEKNİKLERİ SOUTHERN BLOT TURGUT ZENGİN."— Sunum transkripti:

1 PROTEİN SAFLAŞTIRMA TEKNİKLERİ SOUTHERN BLOT TURGUT ZENGİN

2 İÇİNDEKİLER  Southern Blot tekniği giriş/genel bilgi  Uygulaması  Kullanım alanları  Karşılaştırma

3 Hibridizasyon Tek iplikli nükleik asit moleküllerinin tamamlayıcı gen dizileri ile (enzim veya radyoaktif işaretli prob'larla) uygun koşullarda eşleşerek çift iplikli hibrit moleküller oluşturmasına hibridizasyon denir. DNA-DNA prob hibridizasyonun gerçekleştiği teknik; southern blot tekniğidir.

4 Southern blot, Edwin Southern tarafından geliştirilmiş moleküler genetikde kullanılan hibridizasyon yöntemlerinden ilkidir. Bu yöntemde izole edilen DNA uygun bir restriksiyon enzimi ile kesilir ve belirli sayı ve uzunlukta DNA frangmentlerinin oluşumu sağlanır. Agaroz jel elektroforezyöntemi ile jel üzerinde büyüklüklerine göre birbirinden ayrılan bu fragmentler önce yüksek pH ile denatüre edilip blot yöntemi ile nitroselüloz filtre üzerine geçirilir. Southern Blot

5 32 p (ya da başka bir radyoaktif olmayan nükleotit analoğu) ile işaretli denatüre edilmiş ve incelenecek bölgeye özgü prob, filte üzerinde tutulan fragmentler ile uygun koşullar sağlanarak hibridize edilir. Sonra filtre üzerine bir röntgen filmi konularak otoradyografi işlemi gerçekleştirilir. Prob yalnızca kendisine tümleyici bazları içeren DNA fragmenti ile hibridize olacak ve otoradyogram sonucu bu bandın üzerinde gözlenebilecektir

6 Sourthern Blot Uygulaması Tablo 1.Poliakrilamid jelde protein ayırımının etkin aralığı  Aynı molekül ağırlığa sahip molekülden biri sekonder yapıda ise primere göre daha küçük ve dolayısıyla daha hızlı olacaktır.  Bu nedenle jelde ayrım sekonder/tersiyer yapılar uzaklaştırıldıktan sonra primer yapı içerenler arasında yapılır.

7 Sourthern Blot Uygulaması 1.DNA’nın kesimi/PCR 2.Agaroz jelde ayırım 3.DNA’nın denatürasyonu ; 0.5M NaOH ile dsDNA ssDNA sadece ssDNA transfer olabilir 4. Opsiyonel olarak (>15 kb) 0.2M HCl ile depürinasyon yapılır. 5.Yüksek tuz konsantrasyonunda (3M NaCl) nötralizasyon re-hibridizasyonu önlemek 6.Kapiller transfer 7.Fikzasyon (UV 254 nm veya 80˚C 1-2 saat) 8.Hibridizasyon 9.Görüntüleme (Biotin/streptovidin)

8 Sourthern Blot Uygulaması

9

10 Klon Tanımada Southern Blot Southern blot uygulamasının en yaygın uygulamaları, belirlenmiş bir genin tanımlanması ve klonlanması için yapılan projeler sırasında ortaya çıkar. Örneğin, diğer primatların genomlarındaki insan genlerinin homologlarını tanımlamak için ve hatta geniş tür bariyerlerinde de (örneğin ilgili insan dizileri için problar olarak Drosophila genleri kullanılması) Southern Blot yöntemi kullanılır. Bir başka olasılık da, istenen gen tarafından kodlanan proteinin amino asit sekansını, karışık bir oligonükleotid prob tasarlamak için kullanmaktır.

11 Restriksiyon Fragment Uzunluğu Polimorfizm Analizi Southern hibridizasyonunun ikinci büyük uygulaması, restriksiyon fragmenti uzunluğu polimorfizmi (RFLP) haritalaması olarak adlandırılan ve genom haritalarının çıkarımılmasında önemli olan bir tekniktir. Tek bir restriksiyon enzimi ile farklı bireylerdeki genomik DNA’nın davranışı her zaman aynı dizi fragmentlerini vermez çünkü bazı restriksiyon bölgeleri polimorfiktir. Bazı kişilerde mevcut iken bazılarında bulunmamaktadır. Çünkü genellikle nükleotid sekansındaki bir nokta değişikliği, restriksiyon bölgesini, restriksiyon enzimi tarafından tanınmayan bir sekansa dönüştürür.

12 Bu polimorfik bölgeler, genetik haritalama için belirteç olarak kullanılabilir ve ilk kapsamlı insan haritalarının yapımında önemli bir öneme sahiptir RFLP'ler, Şekil 2'de gösterildiği gibi Southern blot tekniği ile tespit edilir; prob, polimorfik bölgeyi kapsayan bir DNA parçasıdır ve southern blottan sonra tespit edilen restriksiyon fragmantlerinin uzunluklarından polimorfik bölgenin varlığı ya da yokluğu tespit edilir.

13 Southern Blot ile Western Blot’un Karşılaştırılması Southern Blot Bir örnekteki spesifik DNA’nın tanımlanması için kullanılır. Prensibi DNA hibridizasyonudur. Kullanılan prob tek iplikli DNA’dır. DNA fragmentleri, Agaroz jel elektroforezi ile ayrılır. DNA, NaOH kullanılarak denatüre edilerek tek zincirli hale getirilir. Bloke edilme gibi bir adımı yoktur. Yaygın etiketleme yöntemleri arasında floresan etiketleme ve kromojenik boyaların kullanılması yer alır. Western Blot Bir örnekteki spesifik proteinin tanımlanması için kullanılır. Prensibi Antijen-Antikor etkileşimini incelemektir. Kullanılan problar antijenlerin epitoplarına özgün hedeflenen antikorlardır. Proteinler, SDS-PAGE kullanılarak ayrılır. Proteinler, SDS sayesinde denatüre olarak genel bir negatif yük kazanır. Spesifik olmayan antikor alanlarını nitroselülaz kağıt üzerinde bovin serum albümini(BSA) veya süt tozu ile bloke edilebilir. Yaygın etiketleme yöntemleri arasında radyo etiketleme ve işaretlenmiş sekonder antikor kullanımı yer alır.

14 Southern Blot ile Northern Blot’un Karşılaştırılması Southern Blot Bir örnekteki spesifik DNA’nın tanımlanması için kullanılır. Prensibi DNA hibridizasyonudur. Kullanılan prob tek iplikli DNA’dır. DNA fragmentleri, Agaroz jel elektroforezi ile ayrılır. DNA, NaOH kullanılarak denatüre edilerek tek zincirli hale getirilir. Yaygın etiketleme yöntemleri arasında floresan etiketleme ve kromojenik boyaların kullanılması yer alır. Northern Blot Bir örnekteki spesifik RNA’nın tanımlanması için kullanılır. Prensibi DNA/RNA hibridizasyonudur. Kullanılan prob tek cDNA veya cRNA’dır. RNA fragmentleri,ekstra formaldehitli Agaroz jel elektroforezi ile ayrılır. Denatürasyon yapılmasına ihtiyaç yoktur. Yaygın etiketleme yöntemleri Southern Blot ile aynıdır.

15 KAYNAKÇA 1.Tezel, G.,G.Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot. Hacettepe Üniversitesi, Tıp Fakültesi,Patoloji Anabilim Dalı. 2013. 2.Brown T.A., Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction. 5th edition. Manchester, 2010, Blackwell Publishing. 3.Southern Blot. https://tr.0wikipedia.org/index.php?q=aHR0cHM6Ly90ci53aWtpcGVkaWEub3 JnL3dpa2kvU291dGhlcm5fYmxvdA (erişim; 15.10.2017 19:52) 4.Çavuşoğlu, Z., B. Klinik Örneklerden İzole Edilen Staphylococcus aureus Suşlarından Elde Edilen Bakteriyofajlarda Bulunan SCIN, CHIPS, SEI, SEK Toksin Genlerinin Varlığının PZR ve Southern Blot Yöntemi İle Kıyaslanması. Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü. Ankara. 2012. 5.Thermo Fisher Scientıfic. Southern Blotting. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/dna-rna-purification- analysis/nucleic-acid-gel-electrophoresis/southern-blotting.html. (erişim; 14.10.2017 22:05) https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/dna-rna-purification- analysis/nucleic-acid-gel-electrophoresis/southern-blotting.html