Sunuyu indir
Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz
1
Reverse Transkriptaz ile cDNA Üretimi
Arş. Gör. F. Necmiye KACI Erzurum Teknik Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü
2
cDNA (complementary DNA)
cDNA tek veya çift zincirli olabilir. mRNA kalıbından revers transkriptaz kullanılarak sentezlenir. Bu proses, RT reaksiyonu ve tek zincirli cDNA sentezi olarak bilinir. Eğer yapılan deney çift sarmallı cDNA gerektiriyorsa, bir başka DNA sentez basamağı ile gerçekleştirilebilir. Bu metodla, mRNA ekspresyon seviyeleri belirlenebilir ve klonlanan cDNA sayesinde genlerin ekspresyonu kalitatif ve kantitatif olarak daha ayrıntılı incelenebilir.
3
RT-PCR Tekniği Sensitivitesi yüksek bir deteksiyon tekniğidir.
Düşük kopya sayısı içeren az miktarda RNA bu yöntem ile saptanabilir. mRNA’yı cDNA‘ya çevirmenin amacı mRNA’yı, daha dayanıklı cDNA sayesinde daha kolay ve ayrıntılı inceleyebilmektir. İncelenen hücredeki genlerin ekspresyon seviyeleri belirlenebilir. mRNA sekansları cDNA formunda klonlanabilir ve bir hücrede eksprese edilen tüm genleri içeren cDNA arşivleri oluşturulabilir. RT-PCR ile klonlanan cDNA sayesinde genlerin ekspresyonu RNA ve protein seviyesinde daha ayrıntılı incelenebilir.
4
RT Reaksiyonu Tek sarmallı RNA’nın Kalıp RNA
Reverse transkriptaz enzimi Reverse transkriptaz buffer Primer dNTP‘ ler RNaz inhibitör kullanılarak cDNA’ya transkripsiyonu
5
RT reaksiyonu için üç tip primer kullanılabilir:
Oligo (dT) primerler, Random (hexamer) primerler, Gen spesifik primerler
6
Reverse transkriptaz enzimi:
Retrovirüslerden elde edilen, AMV (Avian Myeloblastosis Virus) MMLV ( Moloney Murine Leukemia Virus)’e ait reverse transkriptaz enzimleri kullanılır.
7
cDNA Sentezi Reaksiyonu
Random hexamer primer ( ng) 1 µl Reaksiyon buffer (5x) 4 µl Rnase inhibitör (40 units/µl) 1 µl dNTP mix (10 mM) µl ddH2O µl RNA (10 pg- 5 µg total RNA) 1 µl RT (200 units/µl) µl Total Rxn Hacmi µl
8
PCR Conditions 25°C 10 dk (Random primer kullanıldığı için)
85°C 5 dk (Reaksiyon durdurulur) 4°C ∞
Benzer bir sunumlar
