ORBİTRAP İLE YAPILAN TARAMA /MİKTAR TAYİNİ ANALİZLERİ İÇİN METOT VALİDASYON Elmas ÖKTEM OLGUN Mart 2016 Elmas Ö OLGUN

KÜTLE SPEKTROMETRESİ

KÜTLE SPEKTROMETRESİ Fizik'te, Lorentz dönüşümü (veya dönüşümleri) adını Hollandalı fizikçi Hendrik Lorentz'den almıştır. Lorentz ve diğerlerinin referans çerçevesinden bağımsız ışık hızının nasıl gözlemleneceğini açıklama ve elektromanyetizma yasalarının simetrisini anlama girişimlerinin sonucudur. Lorentz dönüşümü, özel görelilik ile uyum içerisindedir. Ancak özel görelilikten daha önce ortaya atılmıştır.

KÜTLE SPEKTROMETRESİ Thermo Scientific LTQ Orbitrap An Overview of the Scientific Literature Michaela Scigelova and David Kusel, Thermo Fisher Scientific Title page reproduced with permission from J. Am. Soc. Mass Spectrom., August 2009, 20 (8). Copyright 2009 Journal of The American Society for Mass Spectrometry Title page reproduced with permission from Anal. Chem., May 15, 2007, 79 (10). Copyright 2007 American Chemical Society. Graphic concept by Lucas Magalsky, illustration by Julie Farrar.

KÜTLE SPEKTROMETRESİ

YAYINLAR Vanhaecke, Lynn, et al. "High resolution orbitrap mass spectrometry in comparison with tandem mass spectrometry for confirmation of anabolic steroids in meat." Analytica chimica acta 767 (2013): 118-127. Gómez-Pérez, María Luz, et al. "Comprehensive qualitative and quantitative determination of pesticides and veterinary drugs in honey using liquid chromatography–Orbitrap high resolution mass spectrometry." Journal of Chromatography A 1248 (2012): 130-138. Virus, E. D., T. G. Sobolevsky, and G. M. Rodchenkov. "Introduction of HPLC/orbitrap mass spectrometry as screening method for doping control." Journal of mass spectrometry 43.7 (2008): 949-957. Mol, Hans GJ, Paul Zomer, and Maarten de Koning. "Qualitative aspects and validation of a screening method for pesticides in vegetables and fruits based on liquid chromatography coupled to full scan high resolution (Orbitrap) mass spectrometry." Analytical and bioanalytical chemistry 403.10 (2012): 2891-2908.

VALİDASYON Validation of analytical procedures is the process of determining the suitability of a given methodology for providing useful J. Guerra, Pharm. Tech. March 1986 Validation is the formal and systematic proof that a method compiles with the requirements for testing a product when observing a defined procedures. G. Maldener, Chromatographia, July 1989

Metot Validasyonu Strateji Planı Nasıl Metot Validasyonu Strateji Planı Validasyon protokolu ve validasyon için SOP hazırlanır Metodun uygulama amacı, kapsamı belirlenir Metodun performans parametreleri ve kabul kiterleri belirlenir Validasyon deneyleri tanımlanır Kullanılacak cihazların performansının metot için yeterli olup olmadığı doğrulanır Kullanılacak maddelerin (kimyasal, standartlar) kalitesi belirlenir

MATRİKS SEÇİMİ A3 Steroids A1 Stilbens Substances Marker Residue Metabolite Matrix Recommended concentration* 17 Beta Oestradiol Serum 0,1 ppb Muscle 1ppb Ethninylestradiol Urine 1 ppb Liver 2 ppb 17 Beta Testosterone serum Male < 6 months:10 ppb Male 6-18 months:10 ppb Female < 18 months 0,5 ppb   Methyltestosterone 17 Beta Trenbelone Melengestrol Melengestrol (acetate) Kidney fat 5 ppb   Medroxyprogesterone A4 Recorcylic acid lactones and derivates CRL GUIDANCE PAPER (7 December 2007) CRLs VIEW ON STATE OF THE ART ANALYTICAL METHODS FOR NATIONAL RESIDUE CONTROL PLANS

MATRİKS SEÇİMİ Ürün grupları Ürün Kategorileri Kategoriye dâhil edilen tipik temsili ürünler   Yüksek su içeriği Yumuşak çekirdekli meyve Elma, armut Çekirdekli meyve Kayısı, vişne, şeftali Diğer meyveler Muz Yumrulu sebzeler Yumru soğan Tohumlu sebzeler/kabaklar Domates, biber, salatalık, kavun Brassica sebzeleri (lahanagiller Karnabahar, Brüksel lahanası, lahana, brokoli Yapraklı sebzeler ve taze otlar Marul, ıspanak, fesleğen Koçanlı ve saplı sebzeler Pırasa, kereviz, kuşkonmaz Yem bitkileri Taze yonca, yem fiği, taze şeker pancarı Taze baklagiller Kabuklu taze bezelye, bezelye, ayşekadın fasulye, bakla, çalı fasulyesi, Fransız fasulyesi Kök ve yumrulu sebzelerin yaprakları Şeker pancarı ve yemlik pancar başı Taze mantarlar Champingnon / Şampinyon mantarı, chanterelles / horoz mantarı Kök ve yumrulu sebzeler veya yem Şeker pancarı ve yem pancarı kökleri, havuç, patates, tatlı patates Yüksek yağ içeriği Ağaç yemişleri Ceviz, fındık, kestane Yağlı tohumlar ve bunların ürünleri Yağlı tohum kolzası, ayçiçeği, pamuk tohumu, soya fasulyesi, yer fıstığı, susam vb. Yağlar ve ezmeler ve bunların ürünleri (örneğin, yerfıstığı ezmesi, tahin) Yağlı meyveler ve ürünleri Zeytin, Avokado ve bunların yağları ve ezmeleri Yüksek nişasta ve/veya protein içeriği ve düşük su ve yağ içeriği Kuru baklagiller/Baklagiller Bakla, kuru bakla, kuru fasulye (sarı, beyaz/lacivert, kahverengi, alacalı), mercimek Tahıllar ve bunların ürünleri Buğday, çavdar, arpa ve yulaf; darı, pirinç, kepekli ekmek, beyaz ekmek, krakerler, kahvaltı gevrekleri, makarna

MATRİKS SEÇİMİ Ürün grupları Ürün Kategorileri Kategoriye dâhil edilen tipik temsili ürünler   Yüksek asit içeriği ve yüksek düşük su içeriği1 Turunçgiller Limon, mandarin, mandalina, portakal Küçük meyveler ve taneli küçük meyveler Çilek, yaban mersini, ahududu, Siyah Frenk üzümü, kırmızı Frenk üzümü, beyaz Frenk üzümü, üzüm Diğerleri Kiwi, ananas, uşkun (rhubarb)  Yüksek şeker ve düşük su içeriği Bal, Kuru meyveler Bal, Kuru üzüm, kuru kayısı, kuru erik, meyveli reçeller “Bulunması zor veya özgün ürünler”2 Şerbetçiotu Kakao çekirdeği ve bunun ürünleri, , Kahve, Çay Baharatlar Et ve Su ürünleri Kırmızı et Sığır, domuz, kuzu, av hayvanları, at Beyaz et Tavuk, ördek, hindi Balık Morina balığı, mezgit, somon, alabalık Sakatatlar3 Karaciğer, böbrek Kabuklular Karides, deniz tarağı, yengeç Süt ve süt ürünleri Süt İnek, keçi ve manda sütü Peynir İnek ve keçi peyniri Süt ürünleri Yoğurt, krema Yumurta Tavuk, ördek, bıldırcın, kaz yumurtaları Hayvansal kökenli gıdadan elde edilen yağlar3 Et yağı Böbrek yağı, domuz yağı Süt yağı Tereyağı Balık yağı Morina karaciğer yağı

MATRİKS SEÇİMİ PARAMETRE EUROCHEM SANCO 2002/657/EC Lineerlik   PARAMETRE EUROCHEM SANCO 2002/657/EC Lineerlik  6 konsantrasyon Kalibrasyon eğrisi boyunca Her gün için 4 konsantrasyonda hazırlanmış matriks ilaveli standarttan hesaplanır. Matriks etkisi Çözücü standartlarından ve matriksle eşleşen standartlardan cevapların karşılaştırılması LOQ  10 en düşük seviyede çalışma Tanım gereği: kanıtlandığı en düşük seviye için doğruluk ve kesinlik kriterleri karşılanmıştır Karar Limiti (CCα) Tespit Limti(CCβ) 3 gün boyunca çalışılmış en düşük konsantrasyondaki çalışmadan hesaplanır. Spesifiklik  10 adet blank çalışması Reaktif körü ve kontrol numunelerinde cevap Doğruluk  10 paralelli CRM çalışması Her iki Standart ekleme seviyesi için ortalama geri kazanımı belirleme CRM numunesi ile 6 tekrarlı yapılan çalışmadan hesaplanır. Kesinlik (RSDr)  3 konsantrasyonda 10 paralel Tekrarlanabilirlik RSDr’sini belirleyin, her iki Standart ekleme seviyesi için belirleyin Tekrarlanabilirlik % RSD’sini belirleyin, her konsantrasyonda hazırlanmış 6 set numuneler için hesaplanır Kesinlik* (RSDwR) Laboratuvar içi tekrar üretilebilirlik belirleyin* 3 gün boyunca 2 farklı kişiden elde edilen çalışmalardan% RSDr hesaplanır. Sağlamlık Ortalama geri kazanım ve RSDwR oluşturma yoluyla devam eden bir metot validasyonundan / verifikasyonundan elde edilir Geri Kaznım Matriks standartlardan elde edilmiş lineariteye akrşılık hesaplanan numunelerin karşılaştırılması Matriks standartlardan elde edilmiş lineariteye karşılık hesaplanan numunelerin karşılaştırılması

KABUL KRİTERLERİ PARAMETRE SANCO 2002/657/EC Lineerlik   Lineerlik Kalıntılar < ±%20 ≤ 1 µg/kg -%50 ile +%20 arasında >1 µg/kg-10 µg/kg -%30 ile +%10 arasında ≥ 10 µg/kg -%20 ile +%10 arasında LOQ ≤MRL Karar Limiti (CCα) Tespit Limti(CCβ) 3 gün boyunca çalışılmış en düşük konsantrasyondaki çalışmadan hesaplanır. Spesifiklik  <%30 LOQ Doğruluk %70-120 ≤ 1 µg/kg -%50 ile +%20 arasında >1 µg/kg-10 µg/kg -%30 ile +%10 arasında Kesinlik (RSDr) < %20 ≥ 10 µg/kg-100 µg/kg %20 > 100 µg/kg-1000 µg/kg %15 ≥ 1000 µg/kg %10 Kesinlik* (RSDwR) 1 µg/kg (*) 10 µg/kg (*) 100 µg/kg %23 1000 µg/kg %16

SANCO DİREKTİFİ KABUL KRİTELERİ

ANABOLİK STEROİDLERİN ORBİTRAP İLE TAYİNİ

ANALİTİK YÖNTEM 5 gr homojenize edilmiş biyolojik doku 10 mL acetate tampon pH 5.2 ayarlanır 100 µL Helix Pomatiadan elde edilmiş Beta Glucunodiase (Helix Pomitia) enzimi ilave edilir 37° C de 15 saat inkübe edilir. 100 mL su ile seyreltilmiş numune kolona yük lenir kolondan geçirilir HLB 60 mg SPE kartuş bir hacim su bir hacim metanol ile şartlandıktan sonra 4000 rpm santrifüjde 5 dk santrifülenir Oda ısısına getirilen numuneye 10 mL Acetonitril ilave edilir. 5 dk vortexlenir. ardından su ile bir hacim ile yıkama yapılır 5 mL Acetonitril ile elusyon yapılır eluent N2 altında kuruluğa kadar uçurulup 100 µL MFA/MFB 80/20 ile çözülür

TANIMLAMA ÇALIŞMALARI Numunelere İS ilave edilerek çalışmalar enjeksiyonlar yapılmıştır. Anabolik etkili steroidlerin tanımlanmasında çalışmalarda kullaınlan İS referans alınarak rölative çıkış zamanları hesaplanmıştır İyon oranları MS/MS fragmentleri ce 13C/12C isotop oranlarına bakılmıştır İdentifikasyondan sonra analit konsantrasyonlarının hesaplanmasında 8 noktalı kalibrasyon eğrisinden alana karşılık gelen konsantrasyonlar hesaplatılmıştır. İnternal standart konsantrasyonu 5µg/kg olarak kullanılmıştır. Çalışma aralığı 0,25-10µg/kg’dır.

TANIMLAMA ÇALIŞMALARI Cihazın farklı resolusyonlardaki madde optimizasyonları incelenmiştir (50,000-100,000 FWHM mass extraction window 5 ppm) Seçicilik ve hassasiyet çalışmaları için mass accuracy ayarları için denemeler yapılmıştır. Düşük mass resolusyonlarının false negative sonuç verme olasılığını arttırdığı görülmüştür. 100,000 FWHM resolusyon seçici olmasına karşın tüm analitlerin optimum biçimde tanımlanabilmesi için 50,0000 FWHM resolusyonun daha uygun olduğu bulunmuştur. Seçicilik için bir kritik parametrede mass extraction window aralığının doğru belirlenmesidir. Optimal aralık her analit için farklı olabileceği için bileşene ait spesifik bir değer olabilmektedir. Bu sebepten dedekte edebilme kapasitesi bu değere göre de değişkenlik gösterebilir. 17 α Hydroxytestosterone için 2,5 ve 5 ppm mass extraction windowu olarak yeterli olduğu görülmüştür 2002/657/EC ye göre bir maddenin tanımlanması için çıkış zamanı ve gerçek kütlesinin bilinmesi yeterli bulunmamaktadır. İkincil bir kütle ile konfirmasyon yapılarak kesin tanımlama yapılması gerekmektedir. Bu yüzden monoisotopic yapı (pattern 13C ion) fragmenti bize konfirmasyonu sağlamaktadır.

OPTİMUM RESOLUSYON VE MASS EXTRACTİON WİNDOW OPTİMİZASYONU

İDENTİFİKASYON ÇALIŞMALARI

METOT VALİDASYONU Spesifiklik için; Öncelikle matrixin zor matrix olmasından dolayı uygun olmayan dalgalanmalara sebep olabileceğinden analiz ile uyumlu bir internal standart seçimi yapılıp kullanılmıştır. Her analit için iki adet transitions izlenmiştir. Spesifiklik için internal std ve temiz olduğu bilenen boş matrix ile 34 adet bileşen ayrı ayrı cihaza enjekte edilmiştir. Seçicilik için; Rölatif çıkış zamanları hesaplanmıştır. 6 adet enjeksiyonun SD <0,006 dk Minumum tanımlama noktası olarak 4 nokta ve üzeri kullanılmıştır. Kalibrasyon Eğrisi için; Matrix Matches eğrisi kullanılmıştır. 0,25-0,5-1-2-4-6-8-10 µg/kg konsantrasyonunda linearite çizilmiştir. R2 ≥ 0,99

METOT VALİDASYONU Doğruluk için; CRM numunesi bulunmadığı için 1-1,5-2 µg/kg ile zenginleştirilmiş/kirletilmiş (spiked) et numuneleri ile çalışma yapılmıştır. 3 Gün boyunca her konsantrasyon için 18 adet numune çalışılmıştır. Geri kazanım aralığı %80.7-119.2 olarak bulunmuştur. Tekrarlanabilirlik için; Doğrukluk çalışmalarından gün içi ve günler arası (tekrarüretilebilirlik) tekrarlanabilirlikler hesaplanmıştır. % RSD <20 den küçük bulunmuştur.

METOT VALİDASYONU

ORBİTRAPTE KANTİTATİF OLARAK BALDA VETERİNER İLAÇ VE PESTİSİT KALINTISI TAYİNİ

ANALİTİK METOT 2,5 gr bal numunesi 50 mL PP tüpe alınır, üzerine 2,5 mL su ve7,5 mL %1 Formic Acid içeren ACN ilave edilir Ekstraksiyon 1 saat mekanik çalkalayıcıda çalkalanır Çalkalama 10 dakika 4000 rpm de santrifüjlenir Çöktürme 2 mL si alınan çözelti 0,45 µ filtreden geçirilerek viale alınır Süzme

TANIMLAMA ÇALIŞMALARI Çalışmalar boyunca her gün multi bileşenli standart ile sistem kontrol edilmiştir. Haftalık olarak cihaz kalibre edilmiştir. Eğer çok yoğunluk var ise 15 günd e bir kalibrasyon mutlaka yapılmıştır. Temiz olduğu test edilerek bulunan bir bal blank olarak seçilmiş ve günlük olarak çalışmalarda enjekte edilerek yanlış pozitif sonuç vermenin önüne geçilmiştir. Aynı zamanda gün içerisinde birkaç enjeksiyonda bir saf solvent ile de sistem kontrol edilmiştir. Yine her gün 50µg/kg spiked edilmiş bir bal numunesi kalibrasyon eğrsine göre içeriği hesaplatılarak günlük kalibrasyon eğrilerinin doğruluğu test edilmiştir. Analitlerin tanımlanması için çıkış zamanların hesaplanması için 50µg/kg spike edilmiş 5 numunenin enjeksiyonları kullanılmıştır. 5 enjeksiyonun SD si hesaplanarak RT±3 SD kuralına göre çıkış zamanları belirlenmiştir. Bazı maddelerin Na bağlı hali yüksek hassasiyette sonuç vermiştir. 20 adet madde (H+NH4)+ yüksek hassasiyette sonuç vermiştir.

TANIMLAMA ÇALIŞMALARI Ortalama mass doğruluğu matrix matched standart enjeksiyonu ile bulunmuştur. 100µg/kg konsantrasyonundaki standarttan 10 adet enjeksiyon yapılmıştır. Ortalama mass hatası < 3 ppm olarak bulunmuştur. %RSD < 25 in altında bulunmuştur. Tox İd ile karşılaştırılan veriler için mass doğruluğu ±5 ppm RT aralığı için ± 1 dk kabul kriteri belirlenerek sonuçlar değerlendirilmiştir. İsotopic yapılarda 13C 37Cl 81Br 34S izotoplarına göre yapılar kullanılmıştır. HCD fragmentöründe parçalanma ürünlerinin bulunması da konfirmasyon için kullanılan yöntemlerden biridir.

TANIMLAMA ÇALIŞMALARI

VALİDASYON ÇALIŞMASI Ekstraksiyon verimliliği; Çoklu analitlerin olduğu çalışmalarda ekstraksiyon yönteminin optimizasyonu önem kazanmaktadır. Bal gibi yoğun matrikslerde bu optimizasyon basamağının irdelenmesi şarttır. Matrix Effect için saf solventte ve matrixte hazırlanmış standart setleri karşılaştırılmıştır. 5 ila 100µg/kg aralığında linearite çalışılmıştır. R2 ≥ 0,98 Gerçeklik parametresi için 10-50-250 µg/kg konsantrayonunda 5 paralel numune çalışılmıştır. %Geri kazanım 70-120 arasında bulunmuştur. Tekrarlanabilirlik ve tekrarüretilebilirlik 10-50-250 µg/kg konsantrayonunda 3 gün boyunca 6 paralel numune hazırlanmıştır. %RSD < 25 olarak bulunmuştur. LOD ve LOQ hesaplanması için 1-5-10-25-50-100 µg/kg konsantrayonunda spike edilmiş numuneler hazırlandı, en düşük 1x103 count a sahip konsantrayon inilebilecek en düşük konsantrasyon olarak kabul edilmiştir. Tox İd de yapılan çalışmalar proseslenerek değerlendirilmiştir. Maddelerin çoğu 10 µg/kg in altında tespit edilebildiği görülmüştür.

VALİDASYON ÇALIŞMASI

VALİDASYON ÇALIŞMASI

SONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ

DOPİNG KONTROLDE ORBİTRAP KULLANIMI

ANALİTİK YÖNTEM 3 mL idrar numunesine 1 mL pH 7 fosfat tampon ilave dilir 30 µL Helix Pomatiadan elde edilmiş beta gluconidase enzimi ilave edilir 56° C de 1 saat inkübe edilir. Oda ısısına getirilen numuneye 0.3 g 2:1 sodyum karbonat:potasyum karbonat ilave edilir 5 mL dietileter ekstraksiyon yapılı N2 altında kuruluğa uçurulan bakiye 100 mcL MFA/MFB 70/30 çözülür. Kolon Hypersil Gold C18 100x2,1mm 1,9 µm Enjeksiyon hacmi 20 mcL Gradient program time % A Mobil faz (su) %B Mobil faz (metanol) Flow(mL/min) 50 0,3 0.5 3.5 65 5.5 100 7 7.01 10 Kolon sicakligi 30 °C Ionization Mode ESI positive Spray Voltage 4 kV Capillary Temp 300°C Sheath Gas 35 au (arbitary units) Auxiliary gas 10 au Skimmer Voltage 18 V Capillary Voltage 35 V Tube lens voltage 95 V Heater Temp 305°C Capillary temp Automatic gain control (AGC) 1x106 ions Mass resolving power 25,000 FWHM Scan Time 0,25 s full MS 10,000 FWHM Scan rate 0,56 Hz Full scan m/z 100-1000 Instrument control and data processing XCalibur 2.2.1 softwarw (Theormo Fisher Scientific, Les Ulis, France) with Qual and Quanbrowser. Genesis peak dedection was applied ToxIDTM 2.1.1 was using for screening and LCQuanTM2.6 (Theormo Scientific)

VALİDASYON ÇALIŞMASI Eurochemin kalitif analiz yöntemlerine göre validasyon yapılmıştır. 5 adet blank, 5 adet 10 ng/mL spike edilmiş numune çalışılmıştır. Geri kazanımlar % 100 e yakın bulunmuştur. Çalışmalarda İS kullanılmıştır. Tekrrarlanabilirlik için %RSD ler hesaplanmıştır. Spesifiklik için temiz olduğu bilinen idrar numunesi ile çalışma yapılmıştır. İnterferans olup olmadığı araştırılmıştır. Seçicilik için farklı grup kimyasallarla (benzer özelliklere sahip corticosteroidler) kirletilmiş numuneler analiz edilmiştir. LOD için 10 enjeksyiyon yapılmış ve SD lar hesaplanmıştır Linearite için 0.05-0.1-1-2-10 ng/mL spike edilmiş matrix match ler hazırlanmıştır. Tekrarlanabilirlik ve tekrarüretilebilirlik 3 ayrı günde tekrarlanarak çalışılmıştır.

ANALİTİK YÖNTEM

ÇALIŞMANIN ÖZETİ 556 adet pestisitin tarama metodunun geçerli kılınma çalışması için 21 temsili matriks 130 adet pestisit için çalışmalar yapılmıştır 50,000 resolusyonda ± 5 ppm mass doğruluğunda Data base ile eşleştirme yapıldığında ana iyon için rt ±30 sn Yanlış pozitif sonuç bulma olasılığı 11,676 adet datanın içerisinden %0,3 lük hata olmuştur. Yanlış negatif sonuç bulma olasılığı 2,730 adet datanın içerisinde 13%,3%,1% (konsantrasyona bağlı olarak 0.01-0.05-0.2 mg/kg)

VALİDASYON ÇALIŞMASI 20 adet temsili matriks ile çalışma yapılmıştır. SDL( Screening detection limit) belirlemelidir. Bu çalışma için SDL değeri 0.01 mg/kg olark belirlenmiştir. Sonuçlar iki adet database te proseslenmiştir. Tox ID ve Xcalibur 0.01-0.05-0.1 mg/kg konsantrasyonunda yanluş pozitif ve yanlış negatif sonuçları her iki database de ayrı ayrı değerlendirilmiştir. Matrixe ve konsantrasyona bağlı ion oranlarının değişimi incelenmiştir. Çalışmaların sonuçları EU krirerleri içerisinde olup olmadıkları incelenmiştir.

BENİ DİNLEDİĞİNİZ İÇİN TEŞEKKÜRLER