Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

Semen analizinde standart ve isteğe bağlı test prosedürleri Doç. Dr. Türkan Yiğitbaşı İstanbul Medipol Üniversitesi Biyokimya Anabilim Dalı, 2014 TKBD-Semen.

Benzer bir sunumlar


... konulu sunumlar: "Semen analizinde standart ve isteğe bağlı test prosedürleri Doç. Dr. Türkan Yiğitbaşı İstanbul Medipol Üniversitesi Biyokimya Anabilim Dalı, 2014 TKBD-Semen."— Sunum transkripti:

1 Semen analizinde standart ve isteğe bağlı test prosedürleri Doç. Dr. Türkan Yiğitbaşı İstanbul Medipol Üniversitesi Biyokimya Anabilim Dalı, 2014 TKBD-Semen Analizi Kursu

2 Sunum Planı  WHO 2010’da belirlenen standart test prosedürleri İsteğe bağlı test prosedürleri İsteğe bağlı test prosedürleri  Testlerle ilgili genel bilgiler  WHO 2010’göre ve uygulanan pratiğe göre test protokolleri

3 Standart test prosedürleri  Semen'in makroskobik,mikroskobik incelenmesi  Spermin sayı,motilite,morfolojik incelenmesi  Sperm vitalite testleri  Semende lökosit ve immatür germ hücresi tayin (peroksidaz boyama) (peroksidaz boyama)  Antisperm antikor testleri

4 Vitalite testleri Hareketsiz spermin canlı olup olmadığı saptanır.Bu testler hücrelerin membran bütünlüğü prensibine dayanmaktadır. Ölü hücrelerde hasarlanan plazma membranı boyayı alır.Hareketsiz spermin canlı olup olmadığı saptanır.Bu testler hücrelerin membran bütünlüğü prensibine dayanmaktadır. Ölü hücrelerde hasarlanan plazma membranı boyayı alır. Tüm numunelerde yapılabilir ancak ileri hareketli sperm oranı %40’ın altında vitalite testleri özellikle önerilir.Alt referans limit %58’dir.Tüm numunelerde yapılabilir ancak ileri hareketli sperm oranı %40’ın altında vitalite testleri özellikle önerilir.Alt referans limit %58’dir.

5 Vitalite değerlendirme Eosin-nigrosin Ölü sperm pembe/kırmızı boyanır Eosin (1%) Ölü sperm pembe/kırmızı boyanır Trypan (0.4%) blue Ölü sperm mavi boyanır. Bu üç test tanı amaçlı kullanılır. Genellikle semen ve boya 1:1 oranında karıştırılır. Slayta yayılır. 40’lık objektif ile 200 sperm sayılarak değerlendirme yapılır. 5 TKBD-Semen Analizi Kursu

6 Hypo-osmotic Swelling Test  Canlı fakat hareketsiz spermin intrastoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) için seçiminde kullanılan bir testtir 1.  Özellikler testiküler biyopsi ile elde edilen sperm değerlendirilir.  Na-sitrat ve fruktozun konsantre solüsyonlarına daldırılan sperm kuyruklarındaki kıvrılma spermin canlı olduğunu gösterir. 1 Lin et al, 1998; Cayan et al, Lin et al, 1998; Cayan et al, 2001

7 HOS testinin yapılışı HOS solüsyonu hazırlanır (0.735 g Sodyum sitrat, g D-fruktoz 100 ml distile suda çözülür) veya ticari solüsyon olarak temin edilir.HOS solüsyonu hazırlanır (0.735 g Sodyum sitrat, g D-fruktoz 100 ml distile suda çözülür) veya ticari solüsyon olarak temin edilir. 1ml HOS solusyonu üzerine 100 µl semen ilave edilir.Karıştırılır. 37 °C’de 5-30 dakika beklenir.1ml HOS solusyonu üzerine 100 µl semen ilave edilir.Karıştırılır. 37 °C’de 5-30 dakika beklenir. Karışımın 10 µl ‘si lam üzerine alınır. 22 mm × 22 mm lamel ile kapatılıp ×40 büyütmede faz kontras mikroskobunda 200 hücre incelenir.Karışımın 10 µl ‘si lam üzerine alınır. 22 mm × 22 mm lamel ile kapatılıp ×40 büyütmede faz kontras mikroskobunda 200 hücre incelenir.

8 Hypo-osmotic Swelling Test Canlı spermin kuyruğu kıvrılır.

9 Lökosit  Erkek üreme sisteminde infeksiyon/inflamasyon İnfertil hastaların % 10-20’sinde gösterilmiş. İnfertil hastaların % 10-20’sinde gösterilmiş.  Semende artmış lökosit sayısı(Lökospermi,piyospermi)infeksiyon ve azalmış sperm kalitesi ile ilişkilidir.  Semende lökosit varlığı reaktif oksijen radikalleri (ROS) üretimine neden olan başlıca kaynaktır 1. Bu nedenle sperm motilitesini ve DNA integritisini bozabilir. 1 Kessopoulou, J Reprod Fertil, 1992 Kessopoulou, J Reprod Fertil, 1992

10 Lökosit Semende lökositler başlangıç testi (Peroksidaz aktivitesinin ölçülmesi) ve daha gelişmiş (immunositokimyasal )yöntemlerle gösterilebilir.Semende lökositler başlangıç testi (Peroksidaz aktivitesinin ölçülmesi) ve daha gelişmiş (immunositokimyasal )yöntemlerle gösterilebilir. Bu yöntemlerle immatür germ hücresi ve lökosit ayrımı yapılır. Bu yöntemlerle immatür germ hücresi ve lökosit ayrımı yapılır. Normal: <1 milyon/mlNormal: <1 milyon/ml

11 Peroksidaz aktivitesi: Peroksidaz pozitif granülositler, semendeki baskın lökosit formudurlar.Peroksidaz pozitif granülositler, semendeki baskın lökosit formudurlar. Semende peroksidaz aktivitesinin rutin olarak ölçülmesi başlangıç tarama tekniği olarak kullanılır.Semende peroksidaz aktivitesinin rutin olarak ölçülmesi başlangıç tarama tekniği olarak kullanılır. Basit ve ucuzdur.Basit ve ucuzdur. Ancak peroksidaz içermeyen lenfosit, makrofaj ve monositlerin tanısını yapamaz.Ancak peroksidaz içermeyen lenfosit, makrofaj ve monositlerin tanısını yapamaz. Wolff, 1995; Johanisson et al., 2000

12 Diaminobenzidin + H 2 O 2 okside diaminobenzidin (kahverengi pigment) Diaminobenzidin + H 2 O 2 okside diaminobenzidin (kahverengi pigment) Peroksidaz Granülosit Yuvarlak hücre NumunePozitif kontrol Negatif kontrol Semen20 μl Peroksidaz20 μl Distile su20 μl Fiksatif1 damla Substrat60 μl Numune karışımından 10 μl alınır. Mikroskopta x40 büyütmede incelenir. LeucoScreen

13 Leucoscreen testinin değerlendirilmesi Granulocytes/ml = Sperm Count X Number of brown cellsGranulocytes/ml = Sperm Count X Number of brown cells Number of sperm Number of sperm Sperm Count = 73 X 10 6 cells/mlSperm Count = 73 X 10 6 cells/ml Number of brown cells = 4Number of brown cells = 4 Number of sperm = 66Number of sperm = 66 Applying the formula: 73 x 10 6 X 4/66 = ~4 x 10 6 granulocytes/mlApplying the formula: 73 x 10 6 X 4/66 = ~4 x 10 6 granulocytes/ml

14 Lökosit ölçüm yöntemi(Monoclonal Antibody technique)  Spermler phosphate buffered salin (PBS) içinde yıkanır ve slayta yayılır.  İmmun-histolojik boyama protokolü uygulanır.

15 L.Murthy

16 Anti-sperm Antikorlar (ASA)  ASA’lar sperm proteinlerine cevap olarak üretilir ve spermi fertilizasyon için yetersiz hale getirir.  ASA’lar direkt olarak spermde, indirekt olarak seminal plazma’da ve serumda ölçülebilir.  Immunobead testi ve MAR testi direkt ölçüm için kullanılan iki testtir.Sonuçları her zaman birbiri ile uyumlu olmayabilir.  Immunobead testi için yıkanmış sperm,MAR testi için semen kullanılır.

17 Immunobead Test (IMB) Prosedürü  Donör spermi, hastadan alınan seminal sıvı ile inkübe edilir.  Sperm birkaç kez yıkanır ve IgG ve IgA kaplı boncuklar ile inkübe edilir.  Mikroskop altında boncuklara bağlanmış spermler sayılarak, yüzdesi hesaplanır.

18 IMB

19

20 MAR Testi Mixed Anti-globulin Reaction  10 µl semen, SpermMar lateks partikülleri ve antiserum lam üzerine pipetlenir.  Semen ve lateks partikülleri 5 saniye karıştırılır arkasından antiserum ile 5 saniye karıştırılır.  Lam, lamel ile kapatılır.Oda ısısında,içine nemli pamuk yerleştirilmiş petri dish’de 2-3 dakika bekletilir.  200 sperm sayılır.Boncuklara bağlanmış sperm yüzdesi % 50’den daha fazla ise anormal kabul edilir. antiserum Lateks partikülleri semen 20 TKBD-Semen Analizi Kursu

21

22 Semen analizinde isteğe bağlı test prosedürleri  Semende lökosit ve immatür germ hücresi tayin (immunokimyasal boyama)  Multiple sperm defekt indeksleri  Sperm ve servikal mukus etkileşimi (post koital test)  Biyokimyasal ölçümler (Fruktoz, çinko,nötral α-glukozidaz)  Bilgisayar destekli semen analizi(CASA sistemleri)

23 Multiple sperm defekt indeksleri  Morfolojik olarak anormal sperm,çoğunlukla birden fazla defekt içerir (baş, mid-piece, kuyruk, rezidüel stoplazma).  Spermdeki morfolojik anomalilerin detaylı ölçümü,basit olarak normal sperm yüzdesini vermekten daha faydalı olabilir.  Bu indeksler fertilite ile ilişkili bulunmuştur.

24 Multiple sperm defekt indeksleri MAI:the multiple anomalies indexMAI:the multiple anomalies index (Jouannet et al., 1988);(Jouannet et al., 1988); TZI: the teratozoospermia index TZI: the teratozoospermia index (Menkveld & Kruger, 1996; Menkveld et al., 2001);(Menkveld & Kruger, 1996; Menkveld et al., 2001); SDI:the sperm deformity index SDI:the sperm deformity index (Aziz et al., 1996, 2004).(Aziz et al., 1996, 2004).

25 Multiple sperm defekt indeksleri nasıl hesaplanır?

26 Multiple sperm defekt indeksleri nasıl değerlendirilir?

27 Postkoital test Servikal mukus, siklus ortasında östrojen etkisi ile sperm penetrasyonuna uygun hale gelir.Bu durum kadından kadına ve her siklus için değişiklik gösterebilir.Servikal mukus, siklus ortasında östrojen etkisi ile sperm penetrasyonuna uygun hale gelir.Bu durum kadından kadına ve her siklus için değişiklik gösterebilir. Post koital testin amacı servikal mukustaki aktif sperm sayısını belirlemek ve canlılığını değerlendirmektir (Sobrero & MacLeod, 1962).Post koital testin amacı servikal mukustaki aktif sperm sayısını belirlemek ve canlılığını değerlendirmektir (Sobrero & MacLeod, 1962).

28 Postkoital testin yapılışı Test ovulasyon zamanında yapılmalıdır.Test ovulasyon zamanında yapılmalıdır. Laboratuvar tarafından servikal mukusun değerlendirilmesi koitustan sonraki 9 ile 14.saat ler arasında yapılmalıdır.Laboratuvar tarafından servikal mukusun değerlendirilmesi koitustan sonraki 9 ile 14.saat ler arasında yapılmalıdır. İğnesiz tüberkülin şırıngası ile posterior vaginal fornix ten olabildiği kadar seminal sıvı alınır.İğnesiz tüberkülin şırıngası ile posterior vaginal fornix ten olabildiği kadar seminal sıvı alınır. Farklı bir kateter ile endoservikal kanaldan alınan seminal sıvı lam üzerine alınır.Üzerine lamel (22 mm × 22 mm) kapatılır.Farklı bir kateter ile endoservikal kanaldan alınan seminal sıvı lam üzerine alınır.Üzerine lamel (22 mm × 22 mm) kapatılır. ×4o büyütmede faz kontrast mikroskobunda incelenir.×4o büyütmede faz kontrast mikroskobunda incelenir.

29 Postkoital testin değerlendirilmesi Mukusta sperm bulunmazsa test negatiftir.Mukusta sperm bulunmazsa test negatiftir. Endoservikal mukusta progressif motil sperm bulunması, servikal etkenlere karşı ve kadın ve erkekteki otoimmuniteye karşı savunma mekanizmalarının geliştiğini gösterir.Endoservikal mukusta progressif motil sperm bulunması, servikal etkenlere karşı ve kadın ve erkekteki otoimmuniteye karşı savunma mekanizmalarının geliştiğini gösterir. Non-progressif motil spermin bulunması servikal mukus veya sperme ait antikorların varlığını gösterebilir.Non-progressif motil spermin bulunması servikal mukus veya sperme ait antikorların varlığını gösterebilir. Başlangıç testi negatif veya abnormal ise test tekrarlanmalıdır.Başlangıç testi negatif veya abnormal ise test tekrarlanmalıdır.

30 Biyokimyasal ölçümler Zayıf semen kalitesi,abnormal spermin testiküler üretiminden ya da spermin epididimde post-testiküler hasarından ya da anormal aksesuar bez sekresyonlarından kaynaklanabilir.Zayıf semen kalitesi,abnormal spermin testiküler üretiminden ya da spermin epididimde post-testiküler hasarından ya da anormal aksesuar bez sekresyonlarından kaynaklanabilir. Bu aksesuar bezlerin sekresyonları, aksesuar bez fonksiyonlarını gösterebilir.Bu aksesuar bezlerin sekresyonları, aksesuar bez fonksiyonlarını gösterebilir.

31 Epididim Prostat Prostat Seminal vezikül  Asit fosfataz  Sitrik asit  Çinko  γ-glutamil transpeptidaz   -Glukozidaz  L-Karnitin  Fruktoz, PG

32 Biyokimyasal ölçümler  Fruktoz  Çinko   -Glukozidaz  Asit fosfataz  Sitrik asit Yukarıdaki tüm biyokimyasal ölçümler için ticari, spektrofotometrik kitler mevcuttur. Yukarıdaki tüm biyokimyasal ölçümler için ticari, spektrofotometrik kitler mevcuttur.

33 Fruktoz ölçümü  Seminal vesikül’ün sekresyon kapasitesini gösterir.  Sperm motilitesinin sağlanmasında enerji kaynağı olarak rolü vardır.  Vesikula seminalislerin fonksiyonel, ejakülatuar duktusların açık olduğunu gösterir.  Fizyolojik değer: mg/dl

34 CASA sistemleri (Computer- assisted semen analysis system) CASA sistemleri için çeşitli üreticiler mevcuttur.CASA sistemleri için çeşitli üreticiler mevcuttur. CASA sistemleri sperm motilitesi ve kinematiği konusunda yeterlidirler.CASA sistemleri sperm motilitesi ve kinematiği konusunda yeterlidirler. Bazıları sperm konsantrasyonunu değerlendirebilir.Bazıları sperm konsantrasyonunu değerlendirebilir. Birkaç tanesinin yarı otomatik morfoloji modülleri vardır.Birkaç tanesinin yarı otomatik morfoloji modülleri vardır.

35 CASA sistemleri (Computer- assisted semen analysis system) CASA sistemleri spermin kinetik parametreleri hakkında yüksek hassasiyete sahiptir,kantitatif ve kayıt edilebilir veri sağlar.CASA sistemleri spermin kinetik parametreleri hakkında yüksek hassasiyete sahiptir,kantitatif ve kayıt edilebilir veri sağlar. Bazı çalışmalar CASA sistemleri ile ölçülen, progresif motil spermin hareket özellikleri ve konsantrasyonu ile fertilizasyon oranını ilişkili bulmuşlardır.Bazı çalışmalar CASA sistemleri ile ölçülen, progresif motil spermin hareket özellikleri ve konsantrasyonu ile fertilizasyon oranını ilişkili bulmuşlardır.

36 CASA sistemleri (Computer-assisted semen analysis system)

37 Farklı CASA sistemleri, spermin hareketindeki varyasyonları tespit etmek için değişik matematik algoritmalar kullanmaktadır.Farklı CASA sistemleri, spermin hareketindeki varyasyonları tespit etmek için değişik matematik algoritmalar kullanmaktadır. Bu nedenle CASA sistemlerinin ölçümlerin karşılaştırılması açısından standardizasyonu yapılmamıştır.Bu nedenle CASA sistemlerinin ölçümlerin karşılaştırılması açısından standardizasyonu yapılmamıştır.

38 CASA sistemleri (Computer- assisted semen analysis system)  CASA sistemlerinin erkek fertilitesini değerlendirme ve prognozu belirlemede, geleneksel semen analizine bariz üstünlüğü yoktur 1.  Kullanılan sistemlerin özellikleri gelişmişse de günümüzde fertiliteyi belirlemedeki rolü henüz araştırma safhasında kabul edilmesi ve rutin kullanılması tartışılmaktadır 2. 1 Krause W, 1995; 2 Samplaski Krause W, 1995; 2 Samplaski. 2010

39 Teşekkür ederim… 39 TKBD-Semen Analizi Kursu


"Semen analizinde standart ve isteğe bağlı test prosedürleri Doç. Dr. Türkan Yiğitbaşı İstanbul Medipol Üniversitesi Biyokimya Anabilim Dalı, 2014 TKBD-Semen." indir ppt

Benzer bir sunumlar


Google Reklamları