Çeşitli Tümör Hücrelerine, Spirulina platensis'den Ekstre Edilen

... konulu sunumlar: "Çeşitli Tümör Hücrelerine, Spirulina platensis'den Ekstre Edilen"— Sunum transkripti:

1 Çeşitli Tümör Hücrelerine, Spirulina platensis'den Ekstre Edilen
Ca-Spirulan, Fikosiyanin ve Ham Ekstraktın Etkisinin in vitro Ortamlarda İncelenmesi 1Doç. Dr. İsmet GÜRHAN, 2Yrd. Doç. Dr. Sacide PEHLİVAN, 3Arş. Gör. Köksal KÜÇÜKAKYÜZ, 1Doç. Dr. Meltem CONK DALAY 4Dr. Memduh Sami TANER, 3Yrd. Doç. Dr. Güven ÖZDEMİR, 5Biyokim.Ebru MANAV 1Ege Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Biyomühendislik Bölümü 2Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı 3Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Anabilim Dalı 4Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Nükleer Tıp Anabilim Dalı 5Ege Üniversitesi Bilim Teknoloji Uygulama ve Araştırma Merkezi (EBİLTEM) Spirulina Nedir? Spirulina platensis, dünyada ticari olarak üretilen ve Türkiye’de de 2000 yılında tamamlanan EBİLTEM destekli bir Üniversite-Sanayi işbirliği projesi sonucunda özel sektör (EGERT) tarafından piyasaya sürülen bir siyanobakteridir. Amacımız Mavi-yeşil alglerden olan Spirulina’dan elde edilecek Ca-Spirulan, fikosiyanin ve total ekstraktının organizma dışı sistemlerde, kültür ortamlarında, çeşitli tümör hücrelerine anti-kanser etkilerinin kültürel ve moleküler boyutlarda incelenmesidir. ÇALIŞMANIN AKIŞ ŞEMASI Spirulina platensis üretimi Spirulina platensis EBİLTEM bünyesinde bulunan pilot tesislerde üretilip kurutma işlemine tabi tutulacaktır Tümör hücre kültürlerinin hazırlanması Çalışmada kullanılacak hücre kültürleri ; CA-46, CACO-2, DAUDI, DOHH-2, EHEB, HELA, HEP-G2, HL-60, K-562, LP-1, MC-116, MCF-7, NAMALWA, NCI-H209, NCI-H295, OPM-2, SW-480, U-266, VERO-B4 Spirulina platensis total ekstrakt eldesi Hasat edildikten hemen sonra dondurma-çözdürme yöntemi ile hücreler parçalanacak sonra su buharı ile ekstraksiyon işlemine tabi tutulacaktır. Süspansiyonun santrifügasyon ile klarifikasyonu ve filtrasyon ile sterilizasyonu yapılacaktır. Fikosiyanin ekstraksiyonu Dondurma-çözdürme işlemini takiben elde edilen süspansiyon amonyum sülfat çöktürmesi ve ardından saflaştırma basamaklarından geçirilecektir Ca-Spirulan eldesi Liyofilize edilmiş Spirulina kaynar suda ekstrakte edildikten sonra TCA ile muamele edilip jel filtrasyonundan fraksiyonlar elde edilecektir Tümör Hücre Kültürlerinin Karakterizasyonu i-Sterilite mikoplazma, bakteri, virus, fungus ii-Üreme özellikleri Karakterize edilen kültürlerin -196oC’de stoklanması Etken maddeler ile hücre kültürlerine testler A- Canlılık Oranının Belirlenmesi XTT dye reduction assay uygulanacaktır. B- Transformasyon indeksi İki tabakalı yumuşak agar tekniği uygulanacaktır. Bu Çalışmayı Neden Düşündük? Mevcut literatür tarandığında Spirulina spp.’nin anti-tümör ve antioksidan özelliği ile ilgili bir çok çalışma ile karşılaştık. Bunlardan bazılarından kısaca bahsedecek olursak; Spirulina platensis’ten izole edilen Ca-Spirulan’ın B16-BL6 melanoma, Colon 26 M3.1 carcinoma ve HT-1080 fibrosarcoma hücrelerinin Matrigel/fibronectin kaplı filtreler üzerinden invazyonunu inhibe ettiği saptanmıştır. (T. Mishima et al.) Spirulina platensis’in suda çözünen ekstraktı 0,08-50 mg/ml konsantrasyonları arasında doza bağımlı olarak HeLa hücrelerindeki herpes simplex virus type 1 (HSV-1)’in replikasyonunu inhibe etmiştir. (K. Hayashi et al.) Spirulina platensis’ten ekstre edilen fikosiyanin human chronic myelogenous leukemia-blast crisis K562 hücrelerinin büyümesini doza bağımlı olarak inhibe etmiştir.(Y. Liu et al. ) Spirulina maxima’nın metanol ekstraktının in vitro ve in vivo sistemlerde bir miktar antioksidan koruma sağladığı gösterilmiştir. (M.S. Miranda et al.) Spirulina platensis’ten izole edilen Ca-Spirulan’ın bazı zarflı virusların (Herpes simplex virus type 1, human cytomegalovirus, measles virus, mumps virus, influenza A virus, HIV-1) replikasyonunu inhibe ettiği saptanmıştır.(K. Hayashi et al.) Reaktivasyon (Yeniden üreyebilme) kontrolu Etken maddeler ile muamele edilen hücre kültürlerinin bu etki kalktıktan sonra tekrar üreyebilme oranlarını belirlemek amacıyla uygulanacaktır. Bu nokta literatürlerde eksiklik olarak göze çarpmaktadır. A- Flovsitometri Hücre kültürlerinin DNA içeriğini belirleyecek hücre siklusu analizini yapabilmek amacıyla uygulanacaktır. B- ELISA ile apototik hücre ölümünün belirlenmesi ELISAPLUSkit (Boeringer, Almanya) kullanılarak C- DNA fragmentasyonu Elde edilen DNA fragmentleri elektroforez işlemine tabi tutulacak ve jel UV’de incelenecektir. i- Enzim analizi Süperoksit dismutaz (SOD), askorbat peroksidaz , peroksidaz , katalaz enzimlerinin aktiviteleri tespit edilecektir. ii- Gen Ekspresyonu Total DNA izole edilerek cDNA’ya çevrilecektir. cDNA’lar üzerinde; hücre yaşam çemberinde önemli kontrol görevi olan p53, bcL-2, c-myc, p21 ya da PCNA genlerinin en az 2 tanesinde gen ekspresyonu olup olmadığı, var ise ekspresyon miktarının kontrol hücrelerle karşılaştırması yapılacaktır. İstatistik değerlendirme Bulgular “Tesadüf blokları faktöryel deneme deseni” yöntemi ile değerlendirilecektir. Referans : *Mishima T, Murata J, Toyoshima M, Fujii H, Nakajima M, Hayashi T, Kato T, Saiki I, 1998, Inhibition of tumor invasion and metastasis by calcium spirulan (Ca-SP), a novel sulfated polysaccharide derived from a blue-green alga, Spirulina platensis. Clin.Exp.Metastasis, 16, Hayashi K, Hayashi T, Morita N, Kojima I, 1993, An extract from Spirulina platensis is a selective inhibitor of herpes simplex virus type 1 penetration into HeLa cells. Phytotherapy Research, 7, 76-80 Liu Y, Xu L, Cheng N, Lin L, Zhang C, 2000, Inhibitory effect of phycocyanin from Spirulina platensis on the growth of human leukemia K562 cells. Journal of Applied Phycology, 12, Miranda M.S, Cintra R.G, Barros S.B.M, Filho J.M, Antioxidant activity of the microalga Spirulina maxima, Brazillian Journal of Medical and Biological Research, 31, Hayashi T, Hayashi K, Maeda M, Kojima I, 1996, Calcium Spirulan, an İnhibitor of enveloped virus replication, from a blue-green alga Spirulina platensis. J. Nat. Prod., 59, 83-87