Dr. Ögr. Üyesi. Yılmaz KAYA METAGENOMİK HAZRILAYANLAR Ayla ÇELİK Serdar ALTUNDEMİR Dr. Ögr. Üyesi. Yılmaz KAYA  

METAGENOMİK NEDİR? Birden fazla mikroorganizma içeren örneklerin izole edilmeden ve kültür edilmesine gerek duyulmaksızın direkt olarak doğal ortamlarından DNA’nın ekstrakte edilmesi ve sekanslama tekniği kullanılarak analiz edilmesidir. Metagenomik, çevresel örneklerden -toprak, su, insan vb…- elde edilmiş genetik materyalin doğrudan incelenmesini içeren yeni bir araştırma sahası olarak son yıllarda oldukça önemli hale gelmiştir.

METAGENOMİĞİN GELİŞİM SÜRECİ Pace ve grubunun 1990’da yaptığı “mikrobiyal toplulukların filogenetik profili için bir araç olarak 16S rRNA analizinin pratik kullanımı” başlıklı araştırmasında tam olarak metagenomik kavramı geçmesede “mikrobiyolojik ekoloji” alt alanının çıkışına öncülük etmiştir. Handelsman 1998'de “Karışık mikrobiyolojik popülasyonların DNA seviyesindeki yaşam alanı temelli incelenmesi” çalışması sırasında metagenomik terimini tanımlamıştır

Metagenomiğin esas alanı prokaryotik çeşitliliğin daha önce bilinenden fazla olduğunun anlaşılması Geleneksel kültüvasyon tekniklerinin sınırlarının belirlenmesi Prokaryotik populasyonların önemli bir biyoteknolojik kaynak olduğunun anlaşılması gibi süreçlerle gelişmiştir.

TEMEL PRENSİBİ Mikrobiyal genomların bir karışımı olan çevresel örneklerden nükleik asitlerin kültürleme işlemi olmaksızın doğrudan izolasyonuna dayanan bir yaklaşımdır Metagenomik çalışmalarda genellikle prokaryotlarda bulunan 16S rRNA genleri kullanılır. Bu genlerin kullanılmasının sebebi evrimsel süreçte korunmuş olmalarının dışında bazı değişken bölgelere de sahip olmalarıdır

16S rRNA Genleri Yaklaşık 1,5kb büyüklüğünde olan 16S rRNA, 3’ ucunda, Anti-Shine-Delgarno dizisini bulundurur ve bu dizi mRNA’daki Shine Delgarno dizisine komplementerdir. 16S rRNA, mRNA’ya translasyon esnasında bu bölgeden bağlanmaktadır ve 23S rRNA ile birlikte, ribozom alt birimlerinin bir arada tutulmasını sağlamaktadır. 16S rRNA genlerinin bir diğer özelliği de filogenetik çalışmalarda yoğun olarak kullanılıyor olmasıdır. Bu tarz çalışmalarda özellikle kullanılmasının sebebi, evrimsel olarak korunmuş olmakla birlikte bazı değişken bölgeler de içermesidir. 70S ribozom Prokaryot canlılarda protein sentezinden görevlidir ve 30S ve 50S olmak üzere iki alt üniteden oluşmaktadır.50S alt ünite 5S ve 23S rRNA’ları 30S alt ünite ise 16S rRNA’yı içermektedir (Schluenzan F., 2000).

METAGENOMİĞİN UYGULAMA ALANLARI Çevresel örneklerde DNA izolasyonu Genomun metabolik olarak aktif hücrelerce zenginleştirilmesi Metagenomik klonları zenginleştirme stratejileri Metagenomik kütüphanelerdeki klonların taranması

Çevresel Örneklerde DNA İzolasyonu Kimyasal Dondurarak öğütme Boncukla homojenizasyon Ultrasonikasyon Fiziksel Fiziksel uygulamalar DNA’yı 5-10 kb’lik veya daha küçük parçalara ayırmaktadır. Bu durumda oluşan kısa DNA parçaları kimerik diziler görülme riskini de arttırmaktadır. Mekaniksel, boncuk ile homojenizasyon metodunun kimyasal parçalama metodlarıyla karşılaştırıldığında daha fazla çeşitliliği ortaya çıkardığı gösterilmiştir (Maarit et al., 2001). Toprak örnekleri gibi yüksek çeşitliliğe sahip mikrobiyal toplulukları barındıran ortamlardan DNA izolasyonu yapılırken, fiziksel ve kimyasal metodların birlikte kullanımının verimi arttırdığı görülmüştür. SDS (Sodyum Dodesil Sülfat) içeren kimyasal parçalama protokollerinin, dondurarak parçalama ve boncukla homojenizasyon gibi metodlara göre daha yüksek DNA verimine sahip olduğu saptanmıştır. Ayrıca sediment örneklerine SDS uygulanması, boncukla homojenizasyondan daha fazla hücre parçalanmasını sağlamaktadır. Ultrasonikasyon: Hücre yapılarını kırmada etkili bir araçtır.Bu etki hücre ıcı materyallerın örnegin hücre matrıksinden nişaştanın çıkarılması için kullanır

Fiziksel uygulamalar DNA’yı 5-10 kb’lik veya daha küçük parçalara ayırmaktadır. Bu durumda oluşan kısa DNA parçaları kimerik diziler görülme riskini de arttırmaktadır. Mekaniksel, boncuk ile homojenizasyon metodunun kimyasal parçalama metodlarıyla karşılaştırıldığında daha fazla çeşitliliği ortaya çıkardığı gösterilmiştir Toprak örnekleri gibi yüksek çeşitliliğe sahip mikrobiyal toplulukları barındıran ortamlardan DNA izolasyonu yapılırken, fiziksel ve kimyasal metodların birlikte kullanımının verimi arttırdığı görülmüştür. SDS (Sodyum Dodesil Sülfat) içeren kimyasal parçalama protokollerinin, dondurarak parçalama ve boncukla homojenizasyon gibi metodlara göre daha yüksek DNA verimine sahip olduğu saptanmıştır. Ayrıca sediment örneklerine SDS uygulanması, boncukla homojenizasyondan daha fazla hücre parçalanmasını sağlamaktadır. Ultrasonikasyon: Hücre yapılarını kırmada etkili bir araçtır.Bu etki hücre içi materyallerın örneğin hücre matriksinden nişaştanın çıkarılması için kullanır

Genomun Metabolik Olarak Aktif Hücrelerce Zenginleştirilmesi Yaklaşık 10 9 prokaryot ve gram başına ortalama 2000 farklı genom içeren toprak olağanüstü bir habitat olarak kabul edilmektedir. Günümüz teknolojisiyle toprak mikrobiyal topluluklarının genom içeriğinin tespitinin çok zor olması nedeniyle mikrobiyal toplulukların bilinen özellikleri dikkate alınarak karmaşık yapının çözülmesi amaçlanmaktadır. Karmaşık yapının anlaşılabilmesi için aktif hücrelerle zenginleştirme işlemleri yapılabilmektedir 1-DNA nın elde edilmesi için ultrasantrifüj 2-Bromdeorksiüridin zenginleştirme yöntemi( metabolik olarak aktif organizmanın DNA sına etiketli bir nükleodit eklenmesi ve bu etikete bağlı olarak DNA nın izole edilmesi) 3-kararlı izotop problama

Metagenomik Klonları Zenginleştirme Stratejileri Klon konsorsiyumunun zenginleştirilmesi Differential display (DD) tekniği İntegronlar ve gen kasetleri PCR uygulamalarıyla taramak

PCR Uygulamalarıyla Çoğaltmak Tall PCR, panhandle PCR,casette PCR, adaptor PCR, ligation PCR ve pre-amlification inverse PCR gibi PCR temelli metodlar her nekadar yorucu ve zaman alıcı olsada ham petrolü ve fenolü parçalayan bakteri populasyonunda yeni gen varyantların elde edilmesinde başarılıdır.

Differential Display (DD) Tekniği Differential Display (DD) rastgele primerler kullanılarak yapılan ters transkripsyon PCR (RTPCR) ile hedef organizma, filogenetik grup ya da metabolik yol izi hedeflenerek çevresel örnekten mikrobiyal transkriptlerin geri kazanılıp analiz edildiği gösterilmiştir. Bu yöntemde birçok zorluğun olmasına rağmen mRNA’ lar geri kazanılmaktadır.

İntegronlar ve Gen Kasetleri Bakteriyel bir populasyonda ki antibiyotik direnç genlerinin yayılımının integronlar ve gen kasetleri gibi çok çeşitli elementler ile sağlandığı kanıtlanmıştır.. Potansiyel olarak yeni gen kaynakları sağlamaktadırlar.

Klon Konsorsiyumunun Zenginleştirilmesi Klon konsorsiyumunun zenginleştirilmesi: Bu uygulayamaya, topraktaki poliklorinat bifenil (PCB)bileşiğinin parçalanmasın da görevli, mozaik bir yol izinin parçaları olan iki yada daha fazla bakteri türünün bir araya getirdiği “PCB parçalama kompleksi gen havuzu” örnek olarak verilebilmektedir. Geçmişteki birçok çalışma da metagenomik kütüphanelerin taranmasında katı besiyerinin kullanıldığı gösterilmiştir, fakat sıvı besiyeri zenginleştirmesinin karışıma daha iyi difüze olması sebebiyle klon konsorsiyumunun izolasyonunda daha etkili olduğu anlaşılmıştır

Metagenomik Kütüphanelerdeki Klonların Taranması

Dizi Tabanlı Analizler Dizi tabanlı analizler; korunmuş DNA dizilerinden tasarlanan hibridizasyon probları ve PCR primerleri kullanılarak, metagenomik kütüphaneden ilgili diziyi taşıyan klonun taranması ilkesine dayanmaktadır. Metagenomik klonların rastgele dizilenmesi önemli keşiflerin yapılmasına yol açmıştır.

İşlev Tabanlı Analizler İstenilen özelliklere sahip klonun saptanmasında ilk basamak olarak işlev bağımlı analizler kullanılmaktadır. Daha sonra izole edilen klonun karakterizasyonu için dizi analizi ve biyokimyasal analizler uygulanmaktadır (Şekil 2.2). İşlevsel analizlerle yeni; antibiyotikler , antibiyotik direnç genleri , Na+ (Li+)/H+ taşıyıcıları ve parçalayıcı enzimler tanımlanmıştır. Metagenomik kütüphanelerin işlevsel olarak taranmasıyla daha önce tanımlanmış enzimler veya yeni enzimler saptanabilmektedir

SORULAR 1) Metagenomik çalışmalarda genellikle prokaryotlarda bulunan …............... genleri kullanılır. (16S rRNA) 2) Metagenomik çalışmalarda 16S rRNA kullanılmasının nedeni nedir? Evrimsel süreçte korunmuş olması ve bazı değişken bölgelere sahip olmalarıdır. 3) Metagenomik uygulama alanları nelerdir? Çevresel örneklerde DNA izolasyonu Genom metabolik olarak aktif hücrelerce zengişleştirilmesi Metagenomik klonları zenginleştirme stratejileri Metagenomik kütüphanelerdeki klonalrın taranması

4) Çevresel örneklerde DNA izolasyonu hangi yöntemlerle yapılır? Kimyasal Dondurarak öğütme Boncukla homojenizasyon Ultrasonikasyon Fiziksel 5) Metagenomik klonları zenginleştirme stratejileri nelerdir? Klon konsorsiyumunun zenginleştirilmesi PCR uygulamalarıyla taramak Differential display (DD) tekniği Integronlar ve gen kasetleri

TEŞEKKÜRLER…