 Plazmidler bakterilerde bulunan, ekstra kromozomal, çift iplikli, dairesel DNA molekülleridirler.  Hücre içerisinde boyutları ve kopya sayıları çeşitlilik.

... konulu sunumlar: " Plazmidler bakterilerde bulunan, ekstra kromozomal, çift iplikli, dairesel DNA molekülleridirler.  Hücre içerisinde boyutları ve kopya sayıları çeşitlilik."— Sunum transkripti:

1

2  Plazmidler bakterilerde bulunan, ekstra kromozomal, çift iplikli, dairesel DNA molekülleridirler.  Hücre içerisinde boyutları ve kopya sayıları çeşitlilik gösteren birden fazla farklı tipte plazmid bulunabilir.  Plazmidler, DNA’nın yapı ve fonksiyonunun moleküler seviyede anlaşılabilmesi için kullanılabilecek ideal model sistemlerdir.  Bunun yanısıra, DNA klonlama çalışmalarında taşıyıcı (vektör) olarak yaygın bir şekilde kullanılmaktadırlar.

3 Plazmidler bakterinin üremesi için gerekli olan temel genleri taşımazlar. Buna karşılık bakteriye;  Uygun olmayan ortam koşullarında yaşayabilme,  Çeşitli toksik maddeler üretme ve toksik maddeleri metabolize edebilme,  Antibiyotiklere dirençlilik ve antibiyotik sentezleyebilme,  Patojen özelliği kazandırma,  Bazıları bakteriye eşey özelliği sağlayabilme gibi nitelikleri kazandıran genleri içerir.

4  Plazmidlerin rekombinant DNA teknolojisi çalışmalarında geniş çapta kullanılması plazmid izolasyon yöntemlerinin geliştirilmesine yol açmıştır.  İzolasyon prosedürleri, elde edilmek istenen plazmid DNA miktarına göre miniprep, midiprep ve maxiprep olmak üzere üçe ayrılır.  Maxiprep yüksek konsantrasyonda plazmid izolasyonu için, midiprep orta miktarda DNA izolasyonu ve miniprep ise düşük miktardaki plazmid izolasyonu için kullanılan prosedürleri ifade etmektedir.

5 Plazmid izolasyonu iki temel aşamadan oluşur:  Gram (+) bakterilerin hücre duvarı gram (-) olanlara göre çok daha kalındır. Dolayısıyla Gram (+) bir bakteriden plazmid izolasyonu yapılacaksa ilk olarak lizozim enzimi kullanılarak hücre duvarı parçalanır ve protoplastlar (hücre duvarı uzaklaştırılmış hücre) elde edilir. Hücre duvarının daha ince olması nedeniyle gram (-) bakterilerde bu işlem uygulanmaz.  İkinci aşama hücre zarının parçalandığı ve hücre bileşenlerinin serbest kaldığı aşamadır. Bu aşamadaki parçalama işleminin gerçekleştirilmesi için deterjanlar kullanılır. Kullanılan iyonik deterjanlar hücre zarındaki fosfolipidleri ve protein bileşenlerini çözerler.

6 Hücre duvarı ve hücre zarının uzaklaştırılmasından sonraki işlemler denatürasyon, nötralizasyon ve geri kazanım aşamalarından oluşur.  Denatürasyon: Çift iplikli DNA molekülünün denatüre olarak ipliklerinin birbirinden ayrıldığı aşamadır.  Nötralizasyon: Uygun pH’daki solusyonlar kullanılarak DNA moleküllerinin renatürasyonu sağlanır.  Geri kazanım: Süpernetanttaki DNA molekülü etanol kullanılarak çöktürülür ve yoğunlaştırılmış bir halde elde edilir.

7 Uygulanan işlemler ve kullanılan kimyasalların etkisi nedeniyle izolasyon, üç farklı formda plazmid eldesiyle sonlanabilir. L: Lineer çift iplikli form OC: Açık halkasal form (DNA ipliklerinden birinde hasar yokken diğerinde kırıklar oluşmuştur) CCC: Kapalı halkasal form (DNA’nın iki ipliği birbirine kovalant olarak bağlanmıştır ve süperdönümlüdür)

8 Plazmid izolasyonunda tercih edilebilecek birçok yöntem vardır. Alkali lizis yöntemi yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biridir. 1. E. coli taşıdığı plazmitte bulunan antibiyotiğe direnç geninin çeşidine göre, o antibiyotiği içeren nutrient broth besiyerinde, 250 dev/dak hızda 37 °C de 1 gece boyunca büyütülür. 2. 1.5 ml kültür eppendorf tüpe aktarıldıktan sonra 12000 rpm’de 1dk 4 °C’de santrifüjlenerek hücreler çöktürülür. Süpernetant atıldıktan sonra pellet üzerine tekrar 1.5 ml kültür eklenir ve aynı şekilde santrifüj yapılır. 3. Süpernetant atıldıktan sonra dipte çökelen hücrelerin üzerine 100 µl soğuk süspansiyon solusyonu ilave edilir ve vortexlenerek homojen bir hücre süspansiyonu elde edilir. 4. 10dk oda sıcaklığında inkübe ettikten sonra tüpe 200 µl lizis solusyonu ilave edilir ve tüp 4-5 kez ters-düz edilerek karışması sağlanır.

9 5. 5 dk buzda bekletildikten sonra 150 µl 5M potasyum asetat eklenir ve tüp 4-5 kez ters-düz edilerek karıştırılır. 15 dk buz içerisinde bekletilir. 6. 13000 rpm ve 4 °C’de 10 dk santrifüj yapılır. 7. Süpernetant pellet kısmına dokunulmadan temiz bir tüpe aktarılır ve üzerine iki birim soğuk etanol eklenerek -20 °C’de 10dk bekletilir. 8. 13000 rpm’de 10dk 4 °C’de santrifüjlenerek plazmid DNA’sı çöktürülür. 9. Üstteki süpernetant atılır. Kalan etanolu uzaklaştırmak için tüp ters cevrilerek 5-10dk oda sıcaklıgında bekletilir. Çökelti 30 µl steril distile suda çözündürülür ve daha sonra kullanmak üzere -20 °C’de muhafaza edilir.

10 Süspansiyon solusyonu, pH 8.0  Glukoz 50 Mm  Tris HCl 25 mm  EDTA 10 mm Lizis çözeltisi (SDS hücre duvarını yıkar, NaOH ise proteinleri ve genomik DNA’yı denature eder)  NaOH 0.2 N  SDS %1 5 M potasyum asetat