ANALİTİK YÖNTEM VALİDASYONU

YÖNTEM: Spesifik bir analitin analizi için uygulanan bir işlem ya da işlemler topluluğuna yöntem denir. ÖLÇÜM: Fiziksel veya kimyasal büyüklüğün deneysel yolla belirlenmesidir.

ANALİTİK VERİLERDE İSTATİSTİKSEL DEĞERLENDİRME Her kimyasal analiz, hata ve belirsizlik içerir. HATA: Gerçek veya doğru kabul edilen değerden sapmadır. * Sistematik Hatalar; Cihaz hataları Yöntem hataları Analizci hataları *Rastgele hatalar

Bu hataları gidermek ve analizi iyileştirmek için, yapılan herhangi bir analizde hataları en aza indirerek, hataların büyüklüklerini kabul edilebilir bir doğrulukla hesaplamak ve bu sonuçlara ne kadar güvenileceğini bilmek gerekir. DOĞRULUK: Ölçüm sonuçlarının gerçek veya gerçek olarak kabul edilen değerden olan farkıdır. Güvenirliliği bilinmeyen bir analitik sonucun hiçbir değeri yoktur !!!

Validasyon Analiz yöntemleri uygulanırken kullanılan yöntemin güvenirliliğinin ispat edilmesi gerekir. Bunun için yapılan çalışmalara Validasyon adı verilir. Bir analitik yöntemin validasyonu, laboratuar çalışmaları ile belirlenen ve istenen analitik uygulamaları için gerekli yöntem performans karakteristiklerinin bulunmasıdır. Performans karakteristikleri analitik parametreler cinsinden ifade edilir ve bu parametreler hem in-vivo hem de in-vitro çalışmalarda kullanılan yöntemler için geçerlidir.

VALİDASYON NE ZAMAN YAPILIR? Metot laboratuarda ilk defa uygulanacağı zaman, Yeni bir metot geliştirildiği zaman, Mevcut metotta değişiklik yapıldığı zaman, Geçerli kılınmış bir metot farklı bir laboratuarda, farklı bir cihazla veya farklı bir analist tarafından kullanıldığında, Kalite kontrol sırasında mevcut metodun zamanla değiştiği anlaşıldığında, İki metodun eşitliğinin karşılaştırılması gerektiğinde yapılır.

Validasyon Çeşitleri 1. Deneyde kullanılacak cihazın kontrolü ve validasyonu 2. Geliştirilen yöntemin geçerliliğini kanıtlamak için veya geliştirilmiş olan bir yöntemdeki parametrelerde yapılan değişikliklerden sonra yapılacak validasyon 3. Cihaz ve ilgili yöntem seçildikten ve validasyonları yapıldıktan sonra gerçekleştirilen analiz yöntemi için sistem uygunluk testleri

Validasyon parametreleri nelerdir? Validasyon yaparken, analitik bir yöntemin kabul edilebilirliğini sağlayan ve validasyon parametreleri denilen aşağıdaki belirli kabul kriterlerine titizlikle uyulmalıdır: 1. Analitin belirli bir matriks içinde, saklama şartlarındaki kararlılığı (stability) 2. Doğrusallık (linearity) 3. Kesinlik (precision) 4. Doğruluk (accuracy) 5.Tekrarüretilebilirlik, Tekrarlanabilirlik (Reproducibility, repeatability) 6. Duyarlılık/hassasiyet (sensitivity) 7. Özgünlük/belirleyicilik, seçicilik (specificity, selectivity) 8. Tutarlılık, sağlamlık (ruggedness, robustness) 9.Tespit ve tayin sınırları (Limits of detection-limits of quantitation)

Validasyon Parametrelerinin Hesaplanmasında Kullanılan İstatistiksel Parametreler ORTALAMA : Sınırlı bir veri takımının Aritmetik Ortalamasıdır. Numune ortalaması( X ): Deneyde kullanılan sınırlı sayıdaki numunelerden elde edilen cevapların ortalaması Gerçek ortalama (µ) : Numune sayısı sonsuza gidecek kadar fazladır.

2. Standart sapma ve varyans Verilerin dağılımını özetler. Veri grubunda yer alan ölçüm sonuçlarının aritmetik ortalamaya ne kadar yakın olduğunu gösterir. Standart sapma büyüdükçe dağılım yaygınlaşır. 1. Dağılımın standart sapması 2. Gerçek standart sapma ( ) 3. Numunenin standart sapması (S) S büyük S küçük

Varyans; Standart sapmanın karesi  (Xi - X)2 i=1 n-1 = n  (Xi - µ)2 i=1 Numunenin standart sapması (S) Gerçek standart sapma ( ) Varyans; Standart sapmanın karesi 2= n  (Xi - µ)2 i=1 S2= n  (Xi - X)2 i=1 n-1

3. Bağıl standart sapma ve varyasyon katsayısı Veri grubundan elde edilen farklı ölçümler arasındaki dağılımın, olması gereken değere uzaklığını belirtir. Ölçümler arasındaki belirsizliği verir. Genellikle % cinsinden verilir (=varyasyon katsayısı, %BSS). BSS= X S %BSS = x100 X S %BSS değeri azaldıkça yöntemin kesinliği artar.

4. Bağıl Hata Analiz sonucunu belirli bir düzeyde değiştirebilen, nedeni bilinen veya bilinmeyen ve ölçülebilen kesin değerlere sahip hatalara bağıl hata (BH), % Sapma (BİAS) denir. (+) işaret ölçüm sonucunun gerçek değerden BÜYÜK (-) işaret ölçüm sonucunun gerçek değerden KÜÇÜK olduğunu gösterir. BH= %Sapma = x100 µ-X µ Ölçülen büyüklüğün gerçek değerden farkının gerçek değere oranıdır

12,35 – 0,02 ml’lik bir büret okumasının bağıl hatası: Örnek: 12,35 – 0,02 ml’lik bir büret okumasının bağıl hatası: Bağıl hata = Xi – Xt/ Xt ya da, Bağıl hata = Mutlak hata / Ölçümün büyüklüğü = 0,02 ml / 12,35 ml = 0,002 olur. Yüzde bağıl hata ise: % Bağıl Hata (Bias) = 100 x Bağıl hata olarak verilir. Yukarıdaki örnekte % bağıl hata, % 0,2’dir. Sabit bir mutlak hata, ölçüm büyüklüğü arttıkça, daha küçük bağıl hata sonucunu doğurur. Bir büret okumasındaki belirsizlik 0,02 ml olarak sabitse, bağıl hata 10 ml’lik hacim için % 0,2 ve 20 ml’lik hacim için % 0,1’dir.

5. Ortalamanın Güven Aralığı Pek çok analizde çok fazla sayıda ölçüm almadan gerçek ortalama değer (µ) bulunamaz. Bununla beraber bu ortalamanın sınırları sistematik hataların olmadığı durumlarda verilen bir olasılık derecesi ile popülasyon ortalamasının beklendiği bir aralıkla tespit edilebilir. Bu şekilde elde edilen sınırlar güven aralığı olarak tanımlanır. GA= X± t  n t= Student t değeri, t tablosundan bulunur. t değeri bulunurken serbestlik derecesinden yararlanılır ve bu değerde deney sayısının bir eksiği yani n-1 olarak alınır. İfade edilirken ortalama değer ± GA olarak verilir.

t tablosu α df 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0.025 0.02 0.01 0.005 0.0025 0.001 0.0005 1 1.000 1.376 1.963 3.078 6.314 12.710 15.890 31.820 63.660 127.300 318.300 636.600 2 0.816 1.061 1.386 1.886 2.920 4.303 4.849 6.965 9.925 14.090 22.330 31.600 3 0.765 0.978 1.250 1.638 2.353 3.182 3.482 4.541 5.841 7.453 10.210 12.920 4 0.741 0.941 1.190 1.533 2.132 2.776 2.999 3.747 4.604 5.598 7.173 8.610 5 0.727 0.920 1.156 1.476 2.015 2.571 2.757 3.365 4.032 4.773 5.893 6.869 6 0.718 0.906 1.134 1.440 1.943 2.447 2.612 3.143 3.707 4.317 5.208 5.959 7 0.711 0.896 1.119 1.415 1.895 2.365 2.517 2.998 3.499 4.029 4.785 5.408 8 0.706 0.889 1.108 1.397 1.860 2.306 2.449 2.896 3.355 3.833 4.501 5.041 9 0.703 0.883 1.100 1.383 1.833 2.262 2.398 2.821 3.250 3.690 4.297 4.781 10 0.700 0.879 1.093 1.372 1.812 2.228 2.359 2.764 3.169 3.581 4.144 4.587 11 0.697 0.876 1.088 1.363 1.796 2.201 2.328 2.718 3.106 3.497 4.025 4.437

Ortalamadaki farklılıklar için Student-t testi 1. Deneysel ortalama ile gerçek değerin karşılaştırılması: Yeni geliştirilen bir analiz yönteminin olması gereken ortalama değerden ne kadar saptığını belirtir. X- µ  N S t= 2. İki deneysel ortalamanın karşılaştırılması: Analizi yapan analizcinin yaptığı deney sonuçlarının iki ayrı grubunun karşılaştırılması gerçekleştirilir. X1 – X2 N1 N2 Sb N1+N2 t= Serbestlik derecesi N1+N2- 2 olarak hesaplanır.

Analiz Sonuçlarının Kesinliğinin Karşılaştırılması (F Testi) İki deneysel grubun standart sapmalarının da karşılaştırılması gerekir. Bunun için F testinden yararlanılır. F testi yöntemlerin kesinliklerini karşılaştırır. S12 S22 F= Bu eşitlikte S12 > S22 dir. Serbestlik derecesi N-1 dir. Hesapla bulunan F değeri tablo F değerinden küçükse iki yöntemin standart sapmaları arasındaki fark anlamsızdır.

KALİBRASYON Yöntemin kalibrasyonu, cihazdan ölçülen sinyal ile analit derişimi arasındaki ilişkinin belirlenmesidir. Bu sayede numunede bulunan herhangi bir türün miktarı tayin edilebilir. En çok kullanılan üç yöntem: 1. Tek noktalı veya çok noktalı standardizasyon (kalibrasyon grafiği) yöntemi 2. Standart ekleme yöntemi 3.İç standart ekleme yöntemi’dir.

1) KALİBRASYON GRAFİĞİ YÖNTEMİ Tek noktalı standardizasyon yönteminde derişimi kesin olarak bilinen tek bir standart çözelti cihaza verilir. Alınan sinyal (Sstandart) ile analit derişimi (CA) arasındaki matematiksel ilişki bulunur: k= Sstandart CA Burada k, analite göre farklılık gösteren sabittir. Bu ilişkiden faydalanılarak numunudeki analit sinyali ile karşılaştırılır. Böylece numunedeki analit derişimi bulunabilir. Ancak standardın derişiminin numunedeki analit derişimine yakın olması gerekir. Bu nedenle çok tercih edilen bir yöntem değildir.

Çok noktalı standardizasyon (kalibrasyon grafiği) yönteminde, derişimi kesin olarak bilinen birkaç standart çözelti (genellikle 5 veya 7 farklı derişimdeki) artan derişimlerde cihaza verilerek sinyal ölçülür. Standart derişimine (CA) karşı cihazdan alınan sinyaller (Sölçülen) grafiğe geçirilir. Elde edilen bu doğruya kalibrasyon grafiği denir y= mx + n r= 0.9999 m= eğim n= kesişim r= korelasyon katsayısı

Kalibrasyon grafiği idealde y eksenini 0 (sıfır) noktasında keser: Sölçülen= m CA (y=mx) Burada m kalibrasyon grafiğinin eğimidir. Kalibrasyon grafiğinin başarısı standart çözeltilerin içinde bulunduğu numune ortamının (matriksin) analit çözeltisinin ortamına benzemesine bağlıdır. Bu tür etkilerde kalibrasyon grafiğinde y eksenini 0 (sıfır) noktasında kesmeyebilir, analit içermeyen çözelti (kör) de sinyal verir: Sölçülen= Skör+m CA (y=mx+n) Skör Burada Skör, kör (tanık) için bulunan sinyaldir. Kalibrasyon grafiğinde noktaların y eksenini kestiği değerdir.

2) Standart Ekleme Yöntemi Ortam (matriks) etkisinin olduğu karmaşık numunelerdeki matriks hatalarını azaltmak için tercih edilen bir yöntemdir. Aynı miktarda ayrı kaplara alınan numunelere, analitin artan derişimlerde standart çözeltisi ilave edilir. İlk numune çözeltisine ilave yapılmaz. Bu çözeltilerin sinyalleri cihazla ölçülür. Numune çözeltisi hepsinde bulunduğundan ortam yaklaşık olarak aynıdır. Cihazdan alınan sinyal eklenen standart hacmine (veya seyrelme dikkate alınarak derişime) karşı grafiğe geçirilir. Doğrunun X eksenini kesim noktasından numunedeki analit derişimi hesaplanır. Numune Standart

3) İç Standart Ekleme Yöntemi İç standart, bir analizde belirli miktarda numuneye, tanık çözeltisine ve kalibrasyon standartlarına eklenen saf maddedir. İç standart olarak; numunede bulunmadığı bilinen, analiz ortamına bozucu etki yapmayan, analit ile aynı yerde sinyal vermeyen, güçlü sinyaller veren ve kimyasal özellikleriyle analite benzeyen maddeler seçilir. Çok noktalı standardizasyondan farkı her bir derişim seviyesindeki standart çözeltilere aynı derişimde iç standart eklenmesidir. Standart analit sinyalinin (Sanalit) iç standart sinyaline (Siçstandart) oranı (Sanalit/Siçstandart), analitin bilinen derişimine karşı grafiğe geçirilirek kalibrasyon grafiği elde edilir. Numuneye de aynı miktarda iç standart eklenerek cihazdan alınan analit ve iç standart sinyal oranları (Sanalit/Siçstandart) okunur. Grafikten bu noktaya karşılık gelen analit derişiminden numunedeki analit miktarı belirlenir. İç standart uygun seçilmişse, bu yolla çizilen kalibrasyon sayesinde hem sistematik hem de belirsiz hatalar giderilebilir.

TİPİK VALİDASYON KARAKTERİSTİKLERİ Doğruluk (Accuracy) Kesinlik (Precision) Seçicilik (Selectivity, specificity) Duyarlık (Sensitivity) Teşhis Sınırı (LOD) Tayin Alt Sınırı (LOQ) Doğrusallık (Linearity) Aralık (Range) Sağlamlık, Kararlılık (Robustness) Tutarlılık (Ruggedness) Stabilite

1- DOĞRULUK: Ölçülen değerin gerçek değere yakınlığının ölçüsüdür. Geri kazanım çalışmaları ile verilir. 3 yolla tayin edilebilir. Referans standart (madde ya da yöntem) ile karşılaştırmak Kör matriks ortamına analizi yapılan maddeyi ilave etmek Analizi yapılan maddeye bulunduğu ortamda standart ekleme yöntemi ile saf madde ilavesi

2- KESİNLİK: Geliştirilen yöntemin normal koşullar altında tekrarlanabilirliğinin ölçüsüdür. % BSS (Bağıl Standart Sapma) sonuçları ile ifade edilir. % BSS= (Standart sapma/Ortalama)x100 Tekrarlanabilirlik (Aynı yöntem, aynı analizci, aynı alet, aynı laboratuvar) Gün içi, Günler arası Tekrarüretilebilirlik (Farklı laboratuarlar, farklı kişiler)

Analiz sonuçlarının birbirine çok yakın olması, doğru sonuçlar elde edildiği anlamına gelmez. Sonuçlar birbirine çok yakın olmalarına rağmen, doğru (gerçek) değerden uzak da olabilirler. Tekrarlama, sonuçların kalitesini arttırır ve onların güvenirliğinin bir ölçüsünü verir. Tekrar numuneleri, aynı zamanda ve aynı yolla analitik işlemin uygulandığı yaklaşık olarak aynı büyüklükteki madde kısımları olmalıdır.

3- SEÇİCİLİK (seçicilik / belirleyicilik) Analizi yapılacak maddenin numunede bulunan diğer yardımcı veya etken maddeler yanında derişiminin tam ve doğru olarak tayin edilebileceğini gösterir. Sadece tek bir analite cevap verecek bir yöntem için belirleyicilik Birden fazla analite cevap verecek yöntem için ise seçicilik olarak tanımlanır.

4. Duyarlık (Sensitivity) Bir cihazın veya bir yöntemin duyarlılığı (analitik hassasiyet), bir analit konsantrasyonundaki küçük farkları ayırt edebilme kabiliyetinin bir ölçüsü yada analitik bir yöntemin düşük konsantrasyonları saptayabilme yeteneği de denilen standart kalibrasyon eğrisinin eğimidir. Kalibrasyon duyarlığı=eğim Analitik duyarlık= m/SS m=eğim SS= kalibrasyon eğrisindeki bir noktadaki ardışık ölçümlerin standart sapması

5- TEŞHİS SINIRI (TS) (LOD): Analizi yapılan örneğin belirdiği fakat kantitatif sınırlar içerisine girmediği en alt derişimdir. (Sinyal/Gürültü oranı 3.3 olarak kullanılır.) LOD= 3.3 x S/ m eşitliği kullanılır. S= Kör çözeltinin; çok az derişimdeki maddenin çözeltisinin veya kesişim değerinin standart sapması, m= Kullanılan kalibrasyon eşitliğinin eğim değeridir.

Gürültü= max.pik – min.pik LOD = S/G x3 LOQ = S/G x10 Gürültü= max.pik – min.pik

6- TAYİN ALT SINIRI (TAS)(LOQ): Analizi yapılan örneğin kabul edilebilir düzeyde kesin ve doğru olarak miktarının tayin edilebileceği, doğrusallık sınırları içerisine girmeyen veya doğrusallığın en alt derişimini oluşturan düzeyidir. (Sinyal/Gürültü oranı 10 olarak alınır.) LOQ= 10 x S/ m eşitliği kullanılır. S ve m değerleri LOD eşitliği ile aynıdır.

7- DOĞRUSALLIK (Linearity): Derişime karşı cevabın doğru orantılı olarak artması ve çizilen grafikte noktaların düz bir çizgi üzerinde veya yakınında yer almasıdır. Eğim, kesişim ve korelasyon katsayısı (r) doğrusallığı veren parametrelerdir. Doğrusallık, r= 0.999 ve üzerinde ise ve değerler çizilen doğrunun üzerinde yer alıyorsa sağlanmış demektir. y=mx + n r=0.9999

8- ARALIK (Range): Yeterli doğruluk, duyarlık ve doğrusallığa sahip yöntemin alt ve üst derişimlerinden oluşmaktadır. Derişim aralığı genellikle seçilen yönteme göre değişir. En düşük noktası LOQ değeridir.

9- KARARLILIK (Robustness): Yöntemin, parametrelerdeki ufak değişimlerden etkilenmeden kalabilme kapasitesidir. Bu parametreler organik çözücü yüzdesi, pH, iyonik güç, sıcaklık gibi etkenlerdir.

10- TUTARLILIK (Ruggedness): Yöntemin gerçek kullanım koşulları altında tekrar edilebilirliğinin saptanmasıdır. Bunun için çalışmanın: - Aynı laboratuvarda farklı analizciler tarafından, - Aynı laboratuvarda farklı cihazlar tarafından, - Farklı laboratuvarda gerçekleştirilmesi gerekir.

11- STABİLİTE: Zorunlu bir validasyon parametresi olmamakla beraber yapılması tavsiye edilir. Tekrar edilebilir ve güvenilir sonuçlar elde edebilmek için numunelerin, standart maddelerin ve kullanılan çözücülerin uygun bir süre (örn. 1 gün, 1 hafta, 1 ay veya ne kadar süreye ihtiyaç duyuluyorsa o kadar süre ) stabilitesini koruması gereklidir.

Belirli bir matriks içindeki analitin, amaçlanan saklama ısısında, dondurma veya çözme dönemlerinin etkisinde, oda ısısında veya diğer çevresel faktörlerin etkisindeki stabilitesidir. Stok solüsyonların ve numunenin kararlılığının belirlenmesi gerekir. Bir çözücü içindeki analitin kararlılığı, saklama koşulları, maddenin kimyasal özellikleri, matriks ve kap sistemine bağlıdır. Kararlılık deneylerindeki koşullar, gerçek numune hazırlama ve analizi sırasında karşılaşılması muhtemel durumları yansıtmalıdır. İstenilen saklama süresinin tamamlanmasından sonra, kararlılık, cihaz tepkisinin taze hazırlanmış solüsyonların tepkisi ile karşılaştırılması ile test edilmelidir.

1. Donma ve Erime Stabilitesi: Analit stabilitesi üç donma ve erime turlarından sonra belirlenmelidir. Analit ayarlanmış depolama sıcaklığında stabil değilse, stabilite örneği üç donma ve erime turu boyunca -70 derecede dondurulmalıdır. 2. Kısa Dönem Stabilite: 2 ile 24 saat arasında oda sıcaklığındaki analitin stabilitesidir. 3. Uzun Dönem Stabilite: Uzun dönem bir stabilite değerlendirmesinde depolama zamanı, son örneğin analiz tarihi ile ilk örneğin toplanma tarihi arasındaki zamanı aşmalıdır. 4. Stok Çözeltinin Stabilitesi: Stok çözelti ve internal standardın stabilitesi en az 6 saatlik oda sıcaklığında değerlendirilmelidir. Stok çözeltiler, uygun periyotlarda dondurulur ya da buzdolabında tutulursa, stabilite belgelenmelidir. 5. Hazırlama Sonrası Stabilite: Otosampler içindeki bekleme zamanını içeren işlenmiş örneklerin stabilitesi belirlenmelidir.

Örnek (Kalibrasyon Yöntemi): Bir çözeltide K tayini için aşağıdaki veriler elde edilmiştir. Buna göre çözeltideki K derişimi nedir. 5 Derişim (ppm) 2 4 6 8 Işık Şiddeti 0,2 0,4 0,6 0,8 Bilinmeyen 0,5 y= 0.1x + 0 r= 1

ÖRNEK RTP yöntemi ile analizi için; Saf Etodolak’dan 2,3 mg tartılarak 5 mL lik balonjoje içerisinde etanol ile çözülmüştür. Buradan aşağıdaki hacimlerde alınarak üzerine gerekli miktarlarda KI ve Na sülfit ilave edilerek 10 mL ye distile su ile seyreltilmiştir. Hacim, µL Okunan sinyal 13 119,774 120,364 120,219 25 188,291 187,288 185,188 50 348,889 341,648 342,423 75 492,076 490,752 479,887 100 642,592 628,405 621,308

2,3 mg / 5 mL = 0,46 mg/mL = 460 µg/mL stok Etodolak çözeltisi Hacim, µL Standart µg/mL Okunan sinyal ortalama 13 0,598 119,774 120,364 120,219 120,119 25 1,15 188,291 187,288 185,188 186,9223 50 2,3 348,889 341,648 342,423 344,32 75 3,45 492,076 490,752 479,887 487,5717 100 4,6 642,592 628,405 621,308 630,7683

Daha sonra her biri 400 mg Etodolak içeren 7 tablet tartılmış ve toplam ağırlıkları 6,2555 g bulunmuştur. Bu tabletler toz edildikten sonra aşağıdaki miktarlarda tartılarak 10 mL etanolde çözülmüş ve buradan alınan 50 µL’ye KI ve Na sülfit ilavesinden sonra 10 mL ye tamamlanmış ve verilen analitik sinyaller okunmuştur. Tartılan tablet tozu, mg Etodolak miktarı, µg/mL Tablet sinyalleri Bulunan miktar, µg/mL Tablet içeriği 10,5 2,35 345,942 2,36 401,6 11,3 2,52 355,491 2,43 385,6 11,2 2,50 365,509 2,51 348,932 2,38 405,2 12,4 2,78 400,642 400

HPLC yöntemi ile analiz için; Saf Etodolak’ tan 2 mg tartılarak 10 mL lik balonjoje içerisinde etanol ile çözülmüştür. Buradan aşağıdaki hacimlerde alınarak mobil faz ile 10 mL ye seyreltilmiştir. Hacim, µL Okunan sinyal 100 1887541 188706 182566 200 391381 403861 407931 300 594773 604544 609032 400 802304 787131 799675 500 1000768 985937 1010671

2 mg / 10 mL = 0,2 mg/mL = 200 µg/mL stok Etodolak çözeltisi Hacim, µL Standart µg/mL Okunan sinyal ortalama 100 2 1887541 188706 182566 186271 200 4 391381 403861 407931 401057 300 6 594773 604544 609032 602783 400 8 802304 787131 799675 769370 500 10 1000768 985937 1010671 999125

Daha sonra her biri 400 mg Etadolak içeren 5 tablet tartılmış ve toplam ağırlıkları 4,416 g bulunmuştur. Bu tabletler toz edildikten sonra tartılarak alkolde çözülmüş mobil faz ile 10 mL ye tamamlanmıştır. Bulunan Tablet sonuçları, mg 399,84 394,80 401,60 398,40 402,80

Xort= 399.5 Xort= 398.8 S=3.11 S=7.57 F Testi Student- t Testi S12 S22 Tablet içeriği (Fosforesans) 401,6 385,6 405,2 400 Tablet içeriği (HPLC) 399,84 394,8 401,6 398,4 402,8 Xort= 399.5 S=3.11 Xort= 398.8 S=7.57 F Testi Student- t Testi S12 S22 F= X1 – X2 N1 N2 Sb N1+N2 t= 7,572 3,112 F= 399,5 – 398,8 5 x 5 5,49 5+5 t= Fhesaplanan = 5,93 thesaplanan = 0,20 tteorik=2.31 (p= 0.05) Fteorik=6.39

Etodolak Fosforesans HPLC Lineer aralık (mg L-1) 0.6-4.6 2-10 Eğim (mg L-1) 128.29 101051.08 Kesişim 43.539 -9185.23 Korelasyon Katsayısı, r 0.9998 0.9999 Eğimin standart hatası 1.29 1022.23 Kesişimin standart hatası 3.67 6780.72 Teşhis sınırı (LOD) (mg L-1) 0.02 0.09 Tayin alt sınırı (LOQ) (mg L-1) 0.08 0.32 Etodolak Fosforesans HPLC Etiket miktarı(mg) 400 Bulunan miktar (mg) 398.8 399.5 Bias % 0.3 0.12 RSD % 1.9 0.78 thesaplanan = 0.20 tteorik=2.31 (p= 0.05) Fhesaplanan = 5.93 Fteorik=6.39

Örnek (Standart Katma Yöntemi): Doğal su numunesinden Fe+3 tayini için alınan 10 ar mL lik kısımlar 5 adet 50 mL lik ölçülü balona konmuştur. 11 ppm Fe+3 içeren çözeltiden sırasıyla 0,0; 5,0; 10,0; 15,0; 20,0 ml bu balonlara ilave edilmiştir. Sonra her balona SCN- ilave edilerek kırmızı renkli Fe(SCN)+2 kompleksi oluşturulmuştur. Bütün balonlar 50 ml’ye tamamlanmıştır. Çözeltilerin absorbansı kolorimetrede sırasıyla 0,240; 0,437; 0,621; 0,809; 1,009 olarak ölçülmüştür. Su numunesindeki Fe+3 derişimi nedir? 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0,0 Absorbans 1,1 2,2 3,3 4,4 ppm standart Çözelti Eklenen standart çözeltinin derişimi hesaplanıp sinyale karşı grafiğe geçirilerek bilinmeyen grafikten bulunur 5x11/50=1,1 ppm 10x11/50= 2,2 ppm 15x11/50=3,3 ppm 20x11/50= 4,4 ppm y= 0.17 x + 0. 24 (r= 0.9999) Bilinmeyen 1,4 ppm (grafikten) 1,4 x 50/10 = 7,0 ppm