Reoksijenizasyon Süresinin Uzatılması Reaktif Oksijen Radikali Düzeyi Artışı ile Paraleldir 1,2,3 Uzm. Dr. Püreda Yazıcı 1Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Araştırma Laboratuvarı, 2Dokuz Eylül Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, 3Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya ABD/İzmir. pureda.yazici@deu.edu.tr Giriş: Koroner arterler kalp kasını besleyen damarlardır. Damardaki tıkanma kalp krizine neden olarak sık rastlanan bir ölüm nedenidir. Endotel hücreleri koroner arterlerin iç yüzeyini döşemektedir. Endotel hücrelerine inflamatuvar hücrelerin tutunması ve endotel altına invazyonu, burada okside LDL’leri makrofajın içine almasıyla oluşan köpük hücreleri ve zamanla damar duvarının hasarlanıp damar içine doğru trombosit tıkaçlarının tutunup damar duvarını sıkıştırması, kalp kasına az kan (iskemi) ve az oksijen gitmesi sonucu kalp krizi oluşmaktadır. Doku yeniden oksijenlenirse O2’ den oluşan serbest radikaller de doku hasarı oluşturmaktadır. Yöntem: Ben de ticari olarak 3. pasajda satın aldığım (Cambrex, Promocell) İnsan Koroner Arter Endotel Hücrelerinde (HCAEC) in vitro olarak hipoksi reoksijenizasyon modeli uyguladım. 3. pasajda satın aldığım hücreleri 6. pasaja kadar flasklarda büyüttüm. Hücreler toplam yaklaşık 8 pasaj görüyor, daha sonra üremiyordu. Dolayısıyla 6. pasaj kalp krizinin sık görüldüğü 6.dekad (50-60 yaş) ‘a tekabül ederek in vitro model gerçeğine uygun hale geliyordu. Hücre kültür ortamı olarak EGM-2 (endothelial growth medium, Cambrex) ve birlikte satılan büyüme faktör ve antibiyotikleri kullanıldı. Hipoksi uygulamak için 10 dk boyunca (%95 N2, %5 CO2)’ lık tüp ile havalandırılan hipoksik kabinet denilen dışarıya hava çıkışı olmayan kapalı bir kapda tutularak O2 satürasyon yüzdesinin düştüğü görüldükten sonra kap içinde CO2 inkübatörüne kaldırıldı. Reoksijenizasyon için (%5 CO2, % 95 hava) tüp ile havalandırılan hücre kültürü flasklarının normal koşullarda idame ettirildiği CO2 inkübatörüne, kabinet içinde tutulmadan direk konuldu. Farklı sürelerde hipoksi ve reoksijenizasyon uygulandı. ROS fluorometrik olarak (invitrogen) ölçüldü. LDH ise spektrofotometrik olarak (Cytotoxity detection kit roche) yüzde sitotoksisite üzerinden saptandı. Bu yöntemle oksijenden türeyen serbest radikaller topluca .OH (730), ONOO-(120), -OCI (6), 1O2 (5) ..O2-(8), H2O2 (2), NO (6), ROO. (17), otooksidasyon (<1) ölçülebilmektedir. Hipoksi-reoksijenizasyon reoktif oksijen radikali (ROS) düzeyini artıracak daha sonra yapılan yeşil çay ve koenzim Q10 inkübasyonu antioksidan özelliğinden dolayı ROS düzeyini düşürecekti. Yüzde sitotoksisite: Örnek LDH’ı – Örnek körü * 100 Maksimum kuyu LDH’ ı Maksimum kuyu LDH’ ı: Son konsantrasyonu %1 Triton X100 katılarak 2 saat inkübasyonla tüm hücreler öldürülüyor sonra LDH ölçümü yapılıyor. Örnek körü: Test ölçüm prensibindekilerle aynı konsantrasyonda LDH reaktifi ve her bir EGCG, Polifenon 60 ve Koenzim Q10 için aynı konsantrasyonda EGCG, Polifenon 60 ve Koenzim Q10, içinde hücre yok. EGCG, Polifenon 60 ve Koenzim Q10’ un kendi renkleri sarı olduğundan böyle bir şeye test sonucunu yanlış olarak saptırmasın diye gerek duydum. Bulgular: HCAEC’de; epigallokateşin-galat (EGCG), Polifenon 60 ve Koenzim Q 10 ile 2 saat süreyle inkübasyon uygulanmış ardından 6 saat hipoksi ve sırasıyla 1-4-18 saat reoksijenizasyona maruz bırakılmıştır. EGCG; yeşil çayın içeriğinde %60 olarak en fazla bulunan bileşenidir. Polifenon 60 ise tüm yeşil çay bileşenlerinin bir karışımıdır. Bu maddelerin farklı dozlarıyla (EGCG:50, 100, 200 µM; Polifenon 60:31.25, 62.5, 125 µgr/ml, Koenzim Q10:10, 50 µM) yapılan 2 saat inkübasyon sonrasında aynı doz grubunda reoksijenizasyon süresinin artırılması ROS düzeyi artışı ile paralel bulunmuştur. 31.25 µgr/ml Polifenon 60 grubunda 18 saat reoksijenizasyon, 1 saat reoksijenizasyondan daha yüksek ROS düzeylerine neden olmuştur (p=0.029). 62.5 µgr/ml Polifenon 60 grubunda 4 saat ve 18 saat reoksijenizasyon, 1 saat reoksijenizasyondan daha yüksek ROS düzeylerine neden olmuştur (p=0.029, p=0.029). 125 µgr/ml Polifenon 60 grubunda 4 saat ve 18 saat reoksijenizasyon, 1 saat reoksijenizasyondan daha yüksek ROS düzeylerine neden olmuştur (p=0.029, p=0.05). 10 µM Koenzim Q10 grubunda 18 saat reoksijenizasyon, 1 saat reoksijenizasyondan daha yüksek ROS düzeylerine neden olmuştur (p=0.029). Bazal grupda ise bu farka rastlanılmamıştır (p>0.05). HCAEC’ de 5 saat hipoksi-2/3/4 saat reoksijenizasyon uygulanmış ve LDH düzeyleri ölçülmüştür. Aynı süredeki hipoksi uygulamasına göre kontrol grubundan daha fazla bir LDH artışına neden olmamıştır. Demek ki reoksijenizasyon uygulaması ROS düzeylerini artırırken LDH düzeyini uygulanan deney koşullarında artırmamıştır. Tek pik hariç? Sonuç: Sonuç olarak şöyle söylenebilir; uygulanan deney protokollerinde, hipoksi süresinden bağımsız olarak, HCAEC' de reoksijenizasyon süresi uzadıkça ROS düzeyi artmaktadır fakat LDH düzeyi? değişmemektedir. 2 saat enkübasyon (EGM-2) (EGCG: 50, 100, 200 µM, Polifenon 60: 31.5, 62.5, 125 µgr/ml), Koenzim Q 10: 10, 50 µM) 6 saat hipoksi (PBS) 1 saat reoksijenizasyon (EGM-2) 4 saat reoksijenizasyon 18 saat reoksijenizasyon 24 saat normoksi (adezyon) 10.000 hücre/kuyu Hipoksik kabin 2 saat normoksi 6 saat normoksi 1 saat normoksi 4 saat normoksi 18 saat normoksi 24 saat normoksi (adezyon) 10.000 hücre/kuyu