PROTEİN SAFLAŞTIRMA TEKNİKLERİ SOUTHERN BLOT TURGUT ZENGİN.

Slides:



Advertisements
Benzer bir sunumlar
MOLEKÜLER SİSTEMATİK NEDİR ? NEREDE VE NASIL KULLANILIR?
Advertisements

ELEKTROFOREZ.
AFLP VE DNA DİZİLEME DENEYSEL AŞAMALARININ KARŞILAŞTIRILMASI
EST ANLATIM YAPAN DİZİLERİN ANALİZLERİ
PROTEİNLERİN DENATÜRE JEL ELEKTROFOREZİ İLE
Aflp markeri ve dna klonlama
DNA DİZİLEME.
AFLP (Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizimi)
DNA ve Genetİk Kod Sağlık Slaytları
ELEKTROFOREZ Arş.Gör. Nahit GENÇER.
MAKSİMUM OLASILIK (MAXİMUM LİKELİHOOD)
SUBTRAKTİF MELEZLEME.
PCR (POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU)
PPD DIŞI SPESİFİK TBC TESTLERİ
Biyoteknoloji ve Genetik II
VİRAL HASTALIKLARIN LABORATUVAR TANISI
(Polymerase Chain Reaction)
BİYOTEKNOLOJİ VE GENETİK MÜHENDİSLİĞİ
PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları
Mutasyon Analiz Teknikleri I
NÜKLEİK ASİTLER NELERDİR? SEDANUR KARAKAYA 9/E 3004.
AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism)
Biyoteknoloji ve Genetik II
TANISAL MOLEKÜLER BİYOLOJİK YÖNTEMLERİN TEMEL PRENSİPLERİ VE KLİNİK ÖNEMİ Dr.Hüsnü PULLUKÇU.
Gen Klonlama.
TIBBİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI DÖNEM I ÖĞRENCİ LABORATUVARI / 2
PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları
Proje Lideri Mehmet Emin VURAL Araştırmacılar : Ahmet KARATAŞ (GAPUTAEM) Necdet AKAY (BDUTAEM) Yrd. Doç. Dr. Selahattin KİRAZ (H.Ü.Z.F.) Doç. Dr. Seyrani.
Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı
BİYOLOJİK VERİTABANLARINA GİRİŞ
ANA SORU: Bir genin kopyalanması (duplikasyonu) nasıl kansere neden olur?
In situ Hibridizasyon (ISH, FISH, GISH, CGH)
MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II:
Arasınav ders ve temaları. Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı , Bahar, Trakya Üniv Tıp Fak 6. Kurul, Neşe Akış, PhD, Tıbbi Mikrobiyoloji.
NÜKLEİK ASİTLER Nükleik asitler ilk olarak hücre çekirdeğinde bulundukları için nükleik asit olarak adlandırılmışlardır. Daha sonraki araştırmalarda hücrenin.
Comt Val158Met Polimorfizminin Obez Erişkinlerdeki Önemi Avşar, Orçun 1,2,3 ;Kuşkucu, Aysegül 2 ; Sancak, Seda 4 ;Genç, Ece 1 1 Tıbbi Farmakoloji Anabilim.
MBKY Lab II: RNA izolasyonu 1. HAFTA
DNA DİZİ ANALİZİ.
GENOMİK.
Polimerase Chain Reaction
MODERN GENETİK UYGULAMALARI. MODERN GENETİK UYGULAMALARI.
RESTRİKSİYON ENDONÜKLEAZLAR
PROTEİN İZOLASYONU VE WESTERN BLOTLAMA
Reverse Transkriptaz ile cDNA Üretimi
B- GENETİK MÜHENDİSLİĞİ ve REKOMBİNANT ÜRÜNLER
Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı
DNA Parçalarının Bağlanması (Ligasyon)
Gen Mühendisliği ve Veteriner Hekimlikte Biyoteknoloji
NÜKLEİK ASİTLER RNA
Polimorfizm/Mutasyon tarama teknikleri
Gen Mühendisliği ve Veteriner Hekimlikte Biyoteknoloji
Gen Mühendisliği ve Veteriner Hekimlikte Biyoteknoloji
cDNA kütüphanesi yapımı
KALITSAL MOLEKÜLÜN BİÇİMİ ve ORGANİZASYONU
ENDÜSTRİYEL ENZİMLERİN REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ ile ÜRETİMİ Turgut ZENGİN
ENDÜSTRİYEL ENZİMLERİN REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ ile ÜRETİMİ Turgut ZENGİN.
LABORATUVAR UYGULAMALARI
Amino Asitler ve Proteinler
Ekstraselüler DNA’nın (eDNA) Biyofilm Yapısındaki Rolü
BİYOLOJİDE ÖZEL KONULAR
 Plazmidler bakterilerde bulunan, ekstra kromozomal, çift iplikli, dairesel DNA molekülleridirler.  Hücre içerisinde boyutları ve kopya sayıları çeşitlilik.
PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları
Mikrodizin Teknolojisi ve Mikrodizin Veri Analizi
PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları
DNA Dizilimi ve Gen İfadesi Düzeyinde Varyasyon
GENOMDA GEN Yakın akraba bakteri türlerinde genom dizilerinin çok benzer olduğunun belirlenmesi ile birlikte, bakteriyal genomlara bakış açımız kökten.
Hazırlayanlar Halime Eda SEFER Kübra ATALAY Ayşenur Efşan YARAR
GENOMİK.
T.C ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ ZİRAAT FAKÜLTESİ REAL-TİME PCR İLKER TOKLUCU MEHMET HAN BAŞTÜRK TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ BÖLÜMÜ    2019-SAMSUN  
ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ ZİRAAT FAKÜLTESİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI GENOMİKLER DERSİ Tarımsal Biyoteknolojide Mobil Genetik Elementlerin.
Sunum transkripti:

PROTEİN SAFLAŞTIRMA TEKNİKLERİ SOUTHERN BLOT TURGUT ZENGİN

İÇİNDEKİLER  Southern Blot tekniği giriş/genel bilgi  Uygulaması  Kullanım alanları  Karşılaştırma

Hibridizasyon Tek iplikli nükleik asit moleküllerinin tamamlayıcı gen dizileri ile (enzim veya radyoaktif işaretli prob'larla) uygun koşullarda eşleşerek çift iplikli hibrit moleküller oluşturmasına hibridizasyon denir. DNA-DNA prob hibridizasyonun gerçekleştiği teknik; southern blot tekniğidir.

Southern blot, Edwin Southern tarafından geliştirilmiş moleküler genetikde kullanılan hibridizasyon yöntemlerinden ilkidir. Bu yöntemde izole edilen DNA uygun bir restriksiyon enzimi ile kesilir ve belirli sayı ve uzunlukta DNA frangmentlerinin oluşumu sağlanır. Agaroz jel elektroforezyöntemi ile jel üzerinde büyüklüklerine göre birbirinden ayrılan bu fragmentler önce yüksek pH ile denatüre edilip blot yöntemi ile nitroselüloz filtre üzerine geçirilir. Southern Blot

32 p (ya da başka bir radyoaktif olmayan nükleotit analoğu) ile işaretli denatüre edilmiş ve incelenecek bölgeye özgü prob, filte üzerinde tutulan fragmentler ile uygun koşullar sağlanarak hibridize edilir. Sonra filtre üzerine bir röntgen filmi konularak otoradyografi işlemi gerçekleştirilir. Prob yalnızca kendisine tümleyici bazları içeren DNA fragmenti ile hibridize olacak ve otoradyogram sonucu bu bandın üzerinde gözlenebilecektir

Sourthern Blot Uygulaması Tablo 1.Poliakrilamid jelde protein ayırımının etkin aralığı  Aynı molekül ağırlığa sahip molekülden biri sekonder yapıda ise primere göre daha küçük ve dolayısıyla daha hızlı olacaktır.  Bu nedenle jelde ayrım sekonder/tersiyer yapılar uzaklaştırıldıktan sonra primer yapı içerenler arasında yapılır.

Sourthern Blot Uygulaması 1.DNA’nın kesimi/PCR 2.Agaroz jelde ayırım 3.DNA’nın denatürasyonu ; 0.5M NaOH ile dsDNA ssDNA sadece ssDNA transfer olabilir 4. Opsiyonel olarak (>15 kb) 0.2M HCl ile depürinasyon yapılır. 5.Yüksek tuz konsantrasyonunda (3M NaCl) nötralizasyon re-hibridizasyonu önlemek 6.Kapiller transfer 7.Fikzasyon (UV 254 nm veya 80˚C 1-2 saat) 8.Hibridizasyon 9.Görüntüleme (Biotin/streptovidin)

Sourthern Blot Uygulaması

Klon Tanımada Southern Blot Southern blot uygulamasının en yaygın uygulamaları, belirlenmiş bir genin tanımlanması ve klonlanması için yapılan projeler sırasında ortaya çıkar. Örneğin, diğer primatların genomlarındaki insan genlerinin homologlarını tanımlamak için ve hatta geniş tür bariyerlerinde de (örneğin ilgili insan dizileri için problar olarak Drosophila genleri kullanılması) Southern Blot yöntemi kullanılır. Bir başka olasılık da, istenen gen tarafından kodlanan proteinin amino asit sekansını, karışık bir oligonükleotid prob tasarlamak için kullanmaktır.

Restriksiyon Fragment Uzunluğu Polimorfizm Analizi Southern hibridizasyonunun ikinci büyük uygulaması, restriksiyon fragmenti uzunluğu polimorfizmi (RFLP) haritalaması olarak adlandırılan ve genom haritalarının çıkarımılmasında önemli olan bir tekniktir. Tek bir restriksiyon enzimi ile farklı bireylerdeki genomik DNA’nın davranışı her zaman aynı dizi fragmentlerini vermez çünkü bazı restriksiyon bölgeleri polimorfiktir. Bazı kişilerde mevcut iken bazılarında bulunmamaktadır. Çünkü genellikle nükleotid sekansındaki bir nokta değişikliği, restriksiyon bölgesini, restriksiyon enzimi tarafından tanınmayan bir sekansa dönüştürür.

Bu polimorfik bölgeler, genetik haritalama için belirteç olarak kullanılabilir ve ilk kapsamlı insan haritalarının yapımında önemli bir öneme sahiptir RFLP'ler, Şekil 2'de gösterildiği gibi Southern blot tekniği ile tespit edilir; prob, polimorfik bölgeyi kapsayan bir DNA parçasıdır ve southern blottan sonra tespit edilen restriksiyon fragmantlerinin uzunluklarından polimorfik bölgenin varlığı ya da yokluğu tespit edilir.

Southern Blot ile Western Blot’un Karşılaştırılması Southern Blot Bir örnekteki spesifik DNA’nın tanımlanması için kullanılır. Prensibi DNA hibridizasyonudur. Kullanılan prob tek iplikli DNA’dır. DNA fragmentleri, Agaroz jel elektroforezi ile ayrılır. DNA, NaOH kullanılarak denatüre edilerek tek zincirli hale getirilir. Bloke edilme gibi bir adımı yoktur. Yaygın etiketleme yöntemleri arasında floresan etiketleme ve kromojenik boyaların kullanılması yer alır. Western Blot Bir örnekteki spesifik proteinin tanımlanması için kullanılır. Prensibi Antijen-Antikor etkileşimini incelemektir. Kullanılan problar antijenlerin epitoplarına özgün hedeflenen antikorlardır. Proteinler, SDS-PAGE kullanılarak ayrılır. Proteinler, SDS sayesinde denatüre olarak genel bir negatif yük kazanır. Spesifik olmayan antikor alanlarını nitroselülaz kağıt üzerinde bovin serum albümini(BSA) veya süt tozu ile bloke edilebilir. Yaygın etiketleme yöntemleri arasında radyo etiketleme ve işaretlenmiş sekonder antikor kullanımı yer alır.

Southern Blot ile Northern Blot’un Karşılaştırılması Southern Blot Bir örnekteki spesifik DNA’nın tanımlanması için kullanılır. Prensibi DNA hibridizasyonudur. Kullanılan prob tek iplikli DNA’dır. DNA fragmentleri, Agaroz jel elektroforezi ile ayrılır. DNA, NaOH kullanılarak denatüre edilerek tek zincirli hale getirilir. Yaygın etiketleme yöntemleri arasında floresan etiketleme ve kromojenik boyaların kullanılması yer alır. Northern Blot Bir örnekteki spesifik RNA’nın tanımlanması için kullanılır. Prensibi DNA/RNA hibridizasyonudur. Kullanılan prob tek cDNA veya cRNA’dır. RNA fragmentleri,ekstra formaldehitli Agaroz jel elektroforezi ile ayrılır. Denatürasyon yapılmasına ihtiyaç yoktur. Yaygın etiketleme yöntemleri Southern Blot ile aynıdır.

KAYNAKÇA 1.Tezel, G.,G.Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot. Hacettepe Üniversitesi, Tıp Fakültesi,Patoloji Anabilim Dalı Brown T.A., Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction. 5th edition. Manchester, 2010, Blackwell Publishing. 3.Southern Blot. JnL3dpa2kvU291dGhlcm5fYmxvdA (erişim; :52) 4.Çavuşoğlu, Z., B. Klinik Örneklerden İzole Edilen Staphylococcus aureus Suşlarından Elde Edilen Bakteriyofajlarda Bulunan SCIN, CHIPS, SEI, SEK Toksin Genlerinin Varlığının PZR ve Southern Blot Yöntemi İle Kıyaslanması. Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü. Ankara Thermo Fisher Scientıfic. Southern Blotting. analysis/nucleic-acid-gel-electrophoresis/southern-blotting.html. (erişim; :05) analysis/nucleic-acid-gel-electrophoresis/southern-blotting.html