VİRAL HASTALIKLARIN LABORATUVAR TANISI

... konulu sunumlar: "VİRAL HASTALIKLARIN LABORATUVAR TANISI"— Sunum transkripti:

1 VİRAL HASTALIKLARIN LABORATUVAR TANISI
Prof.Dr.Ömer POYRAZ

2 VİRAL HASTALIKLARIN LABORATUVAR TANISI
Viral hastalıkların çoğunda klinik bulgular birbirine benzediği için, klinik olarak kesin tanı konulması mümkün değildir. Bu yüzden bu tür hastalıkların ayırt edici tanısında laboratuvar testleri oldukça önemlidir. Laboratuvar yöntemleri 3 ana grup altında toplanmaktadır. 1 - Virusun ya da viral antijenlerin araştırılması 2 - Virüsün üretilerek izole edilmesi ve tiplendirilmesi 3 - Virüse özgül antikorların araştırılması

3 VİRÜSÜN YA DA VİRAL ANTİJENLERİN ARAŞTIRILMASI
Bu temele dayanan yöntemler hem kısa zamanda sonuç vermesi yönünden, hem de invitro olarak üretilemeyen virüslerin saptanması bakımından oldukça önemlidirler. Bu amaçla çeşitli yöntemler kullanılmaktadır

4 Elektron Mikroskobu ile İnceleme
Virüsler çok küçük olduğu için ışık mikroskobu ile görülemezler. Bu yüzden klinik örneklerden kesitler hazırlanarak elektron mikroskobu ile incelenirler. Bu yöntem rutin tanı için hem pratik değildir, hem de aynı morfolojik görünüme sahip virüsleri birbirinden ayırmak mümkün değildir. Bu yüzden bu yöntem yalnızca araştırmalarda ve özellikle virüslerin ince yapılarının gözlenmesinde kullanılır.

5 Elektron Mikroskopunun Görünümü

6 İmmün Elektron Mikroskobu ile İnceleme
Bu yöntemde klinik örneklerde bulunabilecek virüsler saflaştırıldıktan sonra, araştırılan virüse özgül antikorlar ile karıştırılarak elektron mikroskobu ile incelenirler. Eğer saflaştırılan virüs, ilave edilen antikora uygunsa, virüslerin biraraya toplanak küme oluşturdukları gözlenir. Bu sayede virüsleri görmek hem kolaylaşır, hem de aynı morfolojideki virüslerin birbirinden ayrılması mümkün hale gelir.

7 Floresan Mikroskopu ile İnceleme
Bu yöntemde virüs içeren inceleme örneği, lam üzerinde floresan boya ile işaretli bilinen antikorlar ile karşılaştırılır. Hazırlanan bu preparat floresan mikroskobunda incelendiğinde, eğer preparatta bilinen antikora uygun virüs varsa floresan renk vererek tanınır hale gelirler.

8 Floresan mikroskopisi iki şekilde yapılır.
A - Direkt Yöntem : Muayene maddesi lam üzerine yayılıp, kurutularak tesbit edilir. Preparat üzerine floresan boya ile işaretlenmiş bilinen antikor eklenir. Eğer virüs antikora uygunsa, işaretli antikorla birleşerek floresan renk verirler. Uygun değilse yıkama işlemi ile bağlanmamış olan işaretli antikorlar ortamdan uzaklaştığı için floresan renk görülmez. B - İndirekt Yöntem : Bu yöntemde inceleme örneği lam üzerine yayılıp kurutulduktan sonra tesbit edilir. Preparat üzerine virüse uygun bilinen antikor eklenir. Bir süre bekledikten sonra yıkanır. Daha sonra floresan boya ile işaretlenmiş antiglobulin, yani antikora uygun antikor eklenir. Bir süre beklenip yıkandıktan sonra floresan mikroskop altında incelenir. Eğer antijene uygun antikor varsa floresan renk vererek görünür hale gelirler.

9 Floresan Mikroskopisi Görüntüleri

10 ELISA Yöntemi ile İnceleme
Enzimle işaretli antikorlar kullanılarak, klinik örneklerde antijen olup olmadığı araştırılır. Antikorla kaplı mikroplak kuyucukları içerisine antijen araştırılacak inceleme örneği konulup, bir süre inkübe edildikten sonra yıkanır. Kaplı antikora uygun antijen bulunması durumunda bu antijenler yıkama ile ortamdan uzaklaştırılamaz. Daha sonra antijene uygun enzimle işaretli antikorlar ilave edilerek bir süre inkübe edilir.

11 ELISA Yöntemi ile İnceleme
İnkübasyon sonunda tekrar yıkandıktan sonra ortamda antijen varsa, enzimle işaretli antikor da buna bağalanacağı için yıkama ile ortamdan uzaklaştırılamaz. Bu durumda ortamda bir miktar enzim tutulmuş olur. Enzim aktivitesini ortaya koymak için ise, ortama enzime uygun substrat eklenir . Ortamda enzim bulunması durumunda substratı parçalayarak renkli görünüm oluşturur. Renk oluşumu pozitif sonucu gösterirken, renk oluşmaması ortamda enzim olmadığını, yani sonucun negatif olduğunu gösterir.

12 ELISA Cihazının ve Deneyinin Görünümü

13 Radio İmmüno Assay ( RIA ) ile İnceleme
Bir radyoaktif madde ile işaretlenmiş antikorlar kullanmak suretiyle, inceleme örneğinde antijen arama temeline dayanır. Eğer antijen antikora uygunsa, ortamda antijen antikor birleşmesine bağlı olarak radyoaktif madde de tutulmakta, gama sayacı ile incelendiği zaman radyoaktif madde olduğu tesbit edilmekte ve dolaylı olarak antijen olduğu gösterilmektedir.

14 Gama Sayacının Görünümü

15 İnklüzyon Cisimciği Araştırılması
Virüslerin hücrelerde üremesi sonucu inklüzyon cisimciği adı verilen, ışık mikroskobunda görülebilen bir takım oluşumlar meydana gelir. Bu cisimcikler viral ürünlerin ya da virüslerin hücrede toplandığı ve küme yaptığı oluşumlardır. İnklüzyon cisimcikleri sitoplazmada, nükleusta ve hem nükleusta hem de sitoplazmada görülebilmektedir. İnklüzyon cisimciklerinin gerek yerleşim yerleri, gerek boyanma özellikleri ve gerekse görünümleri virüslere göre farklılıklar gösterir. Bu yüzden hastalık materyalinden yapılan histolojik preparatlarda hücreler içinde ışık mikroskobu ile inklüzyon cisimciklerinin gösterilmesi tanı yönünden oldukça önemlidir.

16 İnklüzyon Cisimciklerinin Görünümü

17 İmmün Blot (Western Blot) Yöntemi ile İnceleme
Bu yöntemde ilk önce inceleme örneğinin antijenik proteinlerinin ekstraktı hazırlanır. Bu ekstrakt polyakrilamid jel elektroforezine tabi tutulur. Bu sayede antijenik proteinler molekül büyüklüklerine göre ayrılırlar. Bu protein ayrışımı özel yöntemlerle elektroforez cihazından nitrosellüloz filtresine aktarılır. Kurutulan filtre kağıtları şeritler halinde kesilir. Bu nitrosellüloz şeritler, aranılan antijen proteinine karşı spesifik antikorlar ile inkübe edilerek inkübasyon sonunda yıkanır.

18 İmmün Blot (Western Blot) Yöntemi ile İnceleme
Kağıt şeritte aranılan mikroorganizmaya ait antijenik proteinler varsa, antikorlar bu antijenlere yapışır ve yıkamakla ortamdan uzaklaştırılamaz. Daha sonra bu filtre kağıdı üzerine radyoaktif madde, ya da enzimle işaretlenmiş antiglobulin antikorları eklenir. Eğer ortamda antikor var ise bu antiglobulinler de ona yapışırlar. Dolayısıyla ortamda işaretli olan radyoaktif madde ya da enzim tutulmuş olur. Radyoaktif madde özel gama sayacı ile okunarak ortaya konulur. Enzim varlığı ise substrat eklenmesi sonucu, substratın enzim tarafından parçalanarak renk oluşturmasıyla ortaya konulur.

19 Western Blot Cihazının Görünümü

20 Protein Dot Blot Deneyi ile İnceleme
Bu deneyin çalışılması için mikroorganizma antijenlerine karşı özgül antikor taşıyan kurutulmuş nitrosellüloz kağıtlarının elde hazır olarak bulunması gerekir. İnceleme örneklerinden antijenik ekstraktlar hazırlandıktan sonra, antikor içeren kurutulmuş nitrosellüloz kağıtları üzerine damlatılır. Bir süre inkübasyondan sonra ekstrakta uygun antijen varsa antikora yapışır. Antijen antikor birleşmesi olup olmadığını ortaya çıkarmak için, filtre kağıdı üzerine hedef antijene karşı hazırlanmış ve biotinle işaretlenmiş antikor ilave edilir.

21 Protein Dot Blot Deneyi ile İnceleme
Ortamda antijen bulunması durumunda biotinle işaretlenmiş antikorlar bu antijene yapışarak yıkama işlemi ile ortamdan uzaklaştırılamazlar. Daha sonra filtre üzerine peroksidaz ile işaretlenmiş avidin eklenir. Bir süre inkübasyondan sonra tekrar yıkanır. Son olarak üzerine enzime uygun substrat eklenir. Enzim substratı parçalayarak renk oluşumuna yol açar. Renk oluşumu ise pozitif sonucu gösterir.

22 Mikroorganizma Nükleik Asitlerinin Ortaya Konulması ile Yapılan İnceleme
İnceleme örneğinde etken mikroorganizmanın nükleik asidini saptamak, o etkenin ortamda bulunduğunun en iyi göstergesidir. Bu amaçla uygulanan çeşitli yöntemler bulunmaktadır.

23 Southern Blot Hibridizasyon Yöntemi
İlk önce hastalık örneklerinde bulunabilecek DNA' lar özel yöntemlerle saf olarak elde edilir. Yani ekstraksiyonu yapılır. Bu ekstraksiyon üzerine bir restriksiyon enzimi (ECOR) konularak ortamdaki DNA'ların bu enzimin etkisiyle bir çok segmente ayrılması sağlanır. Bu karışım agaroz jel elektroforezine tabi tutularak, DNA segmentleri jel içerisinde birbirlerinden ayrıştırılırlar. Jel üzerindeki bu ayrışım özel transfer yöntemleriyle nitrosellüloz kağıtlarına aktarılır. Bu kağıtlar kurutulduktan sonra şeritler halinde kesilir.

24 Southern Blot Hibridizasyon Yöntemi
Kağıt şeritler 0,5 N NaOH ile muamele edilerek DNA' lar denatüre edilir. Yani iki iplikcikten oluşan DNA' lar ayrışarak tek iplikcikli hale dönüşür. Kağıt şeritler üzerine incelenecek DNA' nın karşıtı olan işaretli DNA, yani komplemanter DNA eklenir. Bu işaretli DNA ya prob DNA adı verilir. Kağıt şerit üzerinde prob DNA' ya uygun karşıt DNA'lar varsa, iki DNA birleşerek yıkama ile ortamdan uzaklaştırılamazlar. Bu olaya hibridizasyon olayı adı verilir. Prob DNA radyoaktif maddelerle işaretlenmişse, birleşme olup olmadığı radyoaktif ışınlara duyarlı filimler kullanılarak, alınan resimlerle anlaşılır. Prob DNA biotin ile işaretlenmişse, bağlanma olup olmadığı kağıt filtre üzerine avidin peroksidaz ve buna uygun substrat eklendikten sonra, renk oluşup oluşmamasına bakılarak anlaşılır.

25 Northern Blot Hibridizasyon Yöntemi
Bu yöntemde inceleme örneğinde viral RNA varlığı araştırılır. Deney Southern Blot yöntemine benzer şekilde uygulanır.

26 Dot Blot Hibridizasyon Yöntemi
Diğer hibridizasyon yöntemlerine göre daha basit uygulanır. Burada inceleme örneği elektroforeze tabi tutulmaz. İlk önce viral nukleik asitler ekstrakte edilir. Bu extrakta ısı ya da NaOH uygulaması ile nukleik asitler denatüre edilirler. Daha sonra bu materyal nitrosellüloz filtresine aktarılır. Bu filtre üzerine işaretli prob DNA' lar eklenir. İnkübasyon ve yıkama işlemlerinden sonra işaretli prob DNA' nın yapışıp yapışmadığı önceki yöntemlerle araştırılır.

27 Polimeraz Zincir Reaksiyonu ( PCR )
Kısaca PCR olarak da bilinen bu yöntem bir tanı yöntemi değildir. Ortamda az miktarda bulunan nükleik asitlerin çoğaltılmasına yönelik bir yöntemdir. Bu sayede nukleik asitlerin sayıca artmasıyla, nukleik asit belirleme yöntemleriyle daha kolay bir şekilde ortaya konulur. Bu yöntemin temeli DNA'nın ortamda DNA polimeraz enzimi ve gerekli nukleotidlerin bulunması durumunda, bol miktarda iplikcik sentez edebilmesi temeline dayanır.

28 Polimeraz Zincir Reaksiyonu ( PCR )
Bu amaçla ilk önce inceleme örneğinin ekstraksiyonu hazırlanır. Bu ekstrakt bir tüpe alındıktan sonra üzerine 4 tür deoksinukleotid trifosfat içeren karışım eklenir. Ayrıca ortama DNA primeri eklenir. Bu primer nukleotidli bir DNA dizisi olup, in vitro olarak çoğaltılması istenen DNA zincirine karşı spesifik olarak sentezlenip hazırlanmıştır. Başka DNA iplikcikleri ile birleşmeyecek özelliktedir. Ayrıca ortama 70-72oC'de işlev gören DNA polimeraz enzimi ilave edilir. Bu enzim termofil yani ısıya dayanıklı bakterilerden elde edilmektedir. Bu amaçla genellikle Thermus aquaticus (Tag enzimi) ya da Thermus thermophilus (Tth enzimi ) enzimleri kullanılır.

29 PCR Deneyinin Basamakları
1 – Denatürasyon 2 – Hibridizasyon 3 – Primerlerin uzatılması ve amplifikasyonu

30 Denatürasyon Çift iplikcikli DNA'yı tek iplikcikli DNA' ya dönüştüren işlemdir. Bu da genellikle virüs içeren ekstraktın oC' ye kadar ısıtılmasıyla sağlanır. Bu işlem sırasında DNA iplikciklerini birbirine bağlayan hidrojen bağlar ayrışarak, DNA tek iplikcikli hale dönüşür. Eğer incelenecek örnek RNA virüsü ise, önce revers transkriptaz enzimiyle RNA'nın DNA kopyası oluşturulur. Daha sonra bu kopya primerin bağlanması için kalıp vazifesi görür.

31 Hibridizasyon Annealing olarak da adlandırılan bu aşamada ısı aniden 50oC'ye düşürülür. Bu ısı derecesinde ortamda bulunan primerler, tek iplikçikli hale gelmiş bulunan DNA üzerinde kendine uygun olan nukleotid dizisiyle hibridize olurlar. Yani bu dizi ile birleşerek çift iplikcikli hale gelirler. Primerler orijinal DNA ipliğinin amplifikasyonunu, yani uzamasını ve çoğalmasını başlatmak amacıyla kullanılır. Bu nedenle öncü anlamına gelen primer olarak adlandırılırlar.

32 Primerin Uzatılması ve Amplifikasyonu
Bu dönemde ısı aniden 70-72oC'ye yükseltilir. Bu ısı derecesinde DNA polimeraz enzimi faaliyete geçer. DNA polimeraz enzimi, ortamdaki nükleotidleri primerlerin ucuna ekleyerek bu yeni oluşan çift iplikcikli DNA dizisinin uzamasını sağlar. Oluşan bu yeni DNA iplikleri, bir sonraki siklusta primerler için kalıp vazifesi görürler.

33 PCR Deneyinin Uygulanması
PCR deneyindeki bu üç aşama bir siklus olarak kabul edilir. Bir siklus 3-5 dakika içinde gerçekleşir. Her bir siklusun sonunda DNA sayısı iki katına çıkar. Bu sikluslar kez tekrarlanır. Yirmi siklusun tamamlanması yaklaşık 3 saat sürer ve bu sürenin sonunda ortamda bulunan tek bir DNA, çoğalarak 1 milyon DNA kopyası elde edilir. PCR deneyinde bu üç aşamalı ısıyı, aynı anda ve hızlı bir şekilde sağlaması için özel cihazlar geliştirilmiştir. Bu cihazlara otomatik ısı düzenleyicisi anlamına gelen " Thermal Cycler " adı verilir. PCR deneyi ile ortamda az miktarda, yani saptanamayacak miktarda bulunan nukleik asitler çoğaltıldıktan sonra, daha önce açıklanan hibridizasyon yöntemlerinden biri kullanılarak, ortamda virüse ait DNA olup olmadığı araştırılır.

34 PCR Deneyinin Şematik Görünümü

35 PCR Deneyinin Şematik Görünümü

36 PCR Deneyinin Şematik Görünümü

37 VİRÜSLERİN İZOLE EDİLMESİ VE TİPLENDİRİMİ
Virüsler zorunlu hücre içi parazitleri olup, üremeleri için mutlaka canlı hücrelere ihtiyaçları bulunur. Virüslerin izolasyonunda şu aşamalar bulunmaktadır. 1 - Usulüne uygun olarak inceleme örneği alınması 2 - İnceleme örneklerinin ekime hazır hale getirilmesi 3 - İnceleme örneğinin uygun canlı sisteme ekimi 4 - Canlı sistemde virüs üreme belirtilerine bakılarak ön tanı 5 - Canlı sistemden pasaj, titrasyon, nötralizasyon deneyleri yapılarak kesin tanı 6 - Bilinen antikorlar kullanılarak serolojik deneylerle tiplendirme

38 Hastadan İnceleme Örneği Alınmasındaki Kurallar
1 - İnceleme örneği mümkün olduğunca hastalığın erken döneminde alınmalıdır. 2 - Alınan örnek mümkünse bekletilmeden ekilmelidir. 3 - Hemen ekilemeyecek örnekler, + 4oC'de buzdolabında saklanmalıdır. Kesinlikle dondurulmamalıdır. 4 - Ekim yapılacak olan canlı sistemleri kontamine etmemek için, inceleme örneğine uygun antibiyotikler eklenmelidir.

39 İnceleme Örneğinin Ekim İçin Hazırlanması
İçinde bakteri bulunmayan kan, plazma, serum, BOS gibi steril vücut sıvıları hiç bir işlem uygulanmadan direkt olarak canlı sistemlere ekilir. Boğaz çalkantı suyu, dışkı gibi bakteri ihtiva eden inceleme örneklerinin ise ekim yapılmadan önce bakterilerden arındırılmaları gerekir. İnceleme örneklerinin bakterilerden arındırılması, antimikrobik ilavesi, filtrelerden süzme ya da yüksek devirde santrifüj ile mümkündür. Hastadan alınan katı haldeki inceleme örnekleri ise, havan içinde tamponlu serum fizyolojik ve steril kum yardımıyla ezilerek santrifüj edilir. Üst sıvı bir tüpe alınır. Daha sonra bakterilerden arındırılarak ekime hazır hale getirilir.

40 İnceleme Örneklerinin Uygun Canlı Sisteme Ekimi
Virüslerin üretilmesinde 3 canlı sistem kullanılır. 1 - Deney Hayvanları 2 - Embriyonlu Yumurta 3 - Hücre Kültürü

41 Deney Hayvanlarının Görünümü
Tavşan Kobay Keme (Rat) Beyaz Fare

42 Embryonlu Yumurtanın Görünümü

43 Hücre Kültürünün Görünümü
Mikroskopik Görünüm Şematik Görünüm Fibroblastik Hücre Epitel Hücresi

44 Günümüzde Kullanılan Yöntem
Günümüzde genellikle hücre kültürleri kullanılır. Genellikle de hücre kültürü olarak maymun böbreği hücre kültürü, insan akciğer fibroblast hücre kültürü, He-la hücre kültürleri kullanılır. Hücre kültürüne ekimde, izole edilmesi beklenen virüsün duyarlı olduğu hücre kültürleri seçilmelidir.

45 Ekim Yapılan Canlı Sistemlerin Virüs Üremesi Yönünden Gözlenmesi
Ekim yapılan canlı sistemler hergün periyodik olarak virüs üreme belirtileri yönünden incelenmelidir. Kaydedilen virüs üreme belirtileri ışığı altında ilk önce virüsün hangi virüs olduğu tahmin edilir. Kesin tanı ve tiplendirme için çeşitli immünolojik yöntemlerden faydalanılır.

46 Üretilen Virüsün Kesin Tanısı ve Tiplendirilmesi
Virüslerin kesin tanısında immünolojik testlerden yararlanılır. Tanımlamada en sık kullanılan deney nötralizasyon deneyidir. Buna ilaveten immün floresan, hemaglütinasyon inhibisyon, hemadsorbsiyon inhibisyon ve kompleman birleşme deneyleri de kullanılabilir.

47 Nötralizasyon Deneyi Viral enfeksiyonlar sırasında virüsün enfektivitesini nötrleyen antikorlar gelişir. Bu antikorlara nötralizasyon antikorları adı verilir. Bu amaçla bilinen nötralizan antikorlar içeren antiserumlar kullanılarak virüslerin identifikasyonu yapılır. İdentifikasyon testi için üreyen virüs üzerine bilinen bağışık serumlar ilave edilir. Bu virüs ve antiserum karışımı belirli bir süre inkübe edildikten sonra, uygun canlı sisteme ekimi yapılır. Eğer virüs bilinen nötralizasyon antikoruna uygunsa, canlı sistemde virüs üremesi gözlenmez. Eğer uygun değilse virüs üremesi görülür. Bu yoldan hareket edilerek virüsün identifikasyonu yapılır.

48 İmmün Floresan Yöntemi
Çeşitli canlı sistemden alınan, virüs ihtiva eden inceleme örneği, floresan boya ile işaretli bilinen antikor ile lam üzerinde karşılaştırılarak floresan mikroskopta incelenir. Eğer preparatta floresan renk oluşursa virüs bilinen antikora uygundur denilir.

49 Hemaglütinasyon İnhibisyon Deneyi
Virüslerin kendilerine uygun hayvan eritrositlerini hemaglütine etme özellikleri vardır. Bu özelliklerine karşı organizmada antikor gelişir. Bilinmeyen virüsler, bilinen hemaglütinin önleyen antikorlar ile karıştırılarak bir süre inkübasyondan sonra, üzerine uygun eritrosit süspansiyonu konulduğunda hemaglütinasyon özelliği kaybolur. Bu şekilde bilinen antikora uygun virüs olup olmadığı araştırılarak, kesin tanı ve tiplendirme yapılır.

50 Hemadsorbsiyon İnhibisyon Deneyi
Hemaglutinasyonu önleyen antikorlar, CPE yapmayan virüslerin identifikasyonu için hücre kültürü içerisine ilave edilir. Bir süre bekledikten sonra yine kültür içerisine duyarlı eritrosit süspansiyonu eklenir. Eğer hemadsorbsiyon olayı olmazsa virüs antikora uygundur denilir.

51 SEROLOJİK YÖNTEMLERLE VİRÜSE ÖZGÜL ANTİKORLARIN ARAŞTIRILMASI
Virüslerin izolasyonu ve identifikasyonu hem zor, hem de pahalı olması nedeniyle her laboratuvarda uygulanamamaktadır. Bu yüzden hem kolay olması, hem de daha ucuz olması nedeniyle çoğu laboratuvarlarda serolojik deneyler tercih edilmektedir. Bundan dolayı viral enfeksiyonların laboratuvar tanısında serolojik deneylerin önemi büyüktür.

52 Akut viral enfeksiyonlarda 4 dönem bulunmaktadır.
1 – Prodromal Dönem 2 – Akut Dönem 3 – Defervesan Dönem 4 – Konvalesan Dönem

53 Prodromal Dönem Bu dönem inkübasyon dönemidir. Konakta virüs saptanabilmektedir, fakat immun yanıt gelişmediği için antikor saptanama-maktadır. Bu dönemde hastalığa özgül tipik klinik bulgular henüz ortaya çıkmamıştır.

54 Akut Dönem Konaktaki virüs çoğalmasının maksimum düzeyde olduğu, hastalığa özgül semptomların ortaya çıktığı dönemdir. Bu dönemde kanda virüse özgül antikorlar oluşmaya başlar ve bu antikorlar saptanabilecek düzeye ulaşır. Virüsün izolasyon şansı oldukça yüksektir. Antikor araştırılması için ilk kan örneğinin alındığı dönemdir.

55 Defervesan Dönem Akut dönem geçirildikten sonra hastalık bulgularının gerilemeye başladığı dönemdir. Bu devrede antikor yanıtı hızla yükselmeye başlar. Buna karşılık virüs izolasyon şansı gittikçe azalır.

56 Konvelesan Dönem Hastalığa özgül belirtilerin tamamen kaybolduğu dönemdir. Virüs izolasyon şansı hiç bulunmaz. Antikor tayini amacıyla ikinci kan örneğinin alındığı dönemdir. Antikor miktarı maksimum düzeye ulaşmıştır.

57 Viral Enfeksiyon Dönemleri

58 Viral Enfeksiyonlar Sırasında Oluşan Antikorlar
1 - Nötralizan antikorlar 2 - Komplemanı bağlayan antikorlar 3 - Hemaglutinasyonu önleyen antikorlar 4 - Spesifik Ig G ve Ig M antikorları

59 Viral Antikorların Saptanması
Günümüzde geliştirilmiş olan hızlı tanı yöntemleri sayesinde virüse özgül Ig G ve Ig M antikorları kolaylıkla saptanabilmektedir. Bu amaçla en sık kullanılan deney ELISA deneyidir. IgG antikorları hastalığın iyileşme döneminde gittikçe yükselen bir şekilde artarak, ömür boyu pozitiflik devam eder. Tek başına IgG pozitifliği geçirilmiş enfeksiyonu gösterir. IgM antikorları ise klinik bulguların başlangıcından itibaren saptanabilir düzeye ulaşarak, pozitiflik durumu 3-6 ay süreyle devam eder. Bu yüzden spesifik IgM' lerin pozitifliği akut enfeksiyonu gösterir.

60 Viral Antikorların Saptanması
Total antikor tayin eden yöntemlerde ise bazı noktaların göz önünde tutulması gerekir. Bu tür testlerle akut enfeksiyon tanısı, akut dönemde alınan kan örneği ile konvalesan dönemde alınan kan örneklerindeki antikor titresinin belirlenmesi ile olur. Bu yüzden bu şekilde çift serumla yapılan serolojik testlerle akut enfeksiyon tanısı koyabilmek için, iki önemli noktanın göz önünde bulundurulması gerekir. 1 - Akut dönemde alınan birinci serum ile, konvalesan dönemde alınan ikinci serum örneği arasında enaz gün olmalıdır. 2 - Birinci serumda saptanan antikor titresi ile , ikinci serumda saptanan antikor titresi arasında en az 4 misli titre artışı, ya da iki basamak artış bulunmalıdır. Örnek : 1/16 - 1/64

61 Enfeksiyon Dönemlerine Göre Virus İzolasyon ve Antikor Saptama Şansı

62 Viral Antikorların Araştırılmasında Kullanılan Serolojik Deneyler
1 - Nötralizasyon Deneyi A - Deney Hayvanlarında B - Hücre Kültüründe C - Embriyonlu Yumurtada 2 - Hemaglütinasyon İnhibisyon Deneyi 3 - Kompleman Birleşme Deneyi 4 - Floresan Antikor Deneyi 5 - İmmun Diffüzyon Deneyi 6 - ELISA Deneyi 7 - Paul - Bunnel Deneyi 8 - Lateks Aglütinasyon Deneyi