PROTEİN İZOLASYONU VE WESTERN BLOTLAMA

... konulu sunumlar: "PROTEİN İZOLASYONU VE WESTERN BLOTLAMA"— Sunum transkripti:

1 PROTEİN İZOLASYONU VE WESTERN BLOTLAMA
@Murat Kasap, PhD

2 Neden Western Blotlama?
Bir protein solüsyonunda, aranan bir proteinin olup olmadığını ve varsa ne kadar olduğunu anlamak için kullanılan bir yöntemdir. Tespit etme Miktar tayini Karşılaştırma Değişim Etkileşim

3 Neye ihtiyacımız var? Proteine Antikora Gerisi teknik alt yapıdan ibaret….

4 GENELDE PROTEİN İZOLASYONU
Hemen her protein için o proteine ait özel bir izolasyon metodu geliştirmek gerekebilir. Miktarı az olan proteinler miktarı çok olan proteinlere göre daha zor izole edilirler

5 Solubilizasyon metotları
1. Dondur-çöz 2. Osmotik basınç 3. Enzimatik güç (Lizozom) 4. Mekanik güçler sonikasyon (ses dalgaları ile parçalama) Grinding (Keskin bir uç yardımı ile parçalama) French press (basınç ile parçalama)

6 Supernatant (SN) Parçalanan hücreler 12,000 ile 18,000xG’ lik güçler kullanılarak santrifuj edilmeli ve santrifügasyon sonunda üstte kalan berrak kısım (işlenmemiş protein çözeltisi- protein özütü) sonraki adımlarda kullanılmalıdır DNase yada RNase muamelesi Protamin sülfat veya streptomycin

7 Protein stabilizasyonu
Protein denatürasyonu kolay bir iş….Nedenleri? pH ve yanlış tampon çözelti seçimi Oda sıcaklığında çalışma Yanlış yerde ve yanlış biçimde saklama Proteazlardan korumama Aşırı seyreltme Köpürtme

8 SDS-PAGE

9 boşlukların büyüklüğünü iki parametre belirler; (1) Kullanılan akrilamid miktarı (2) çapraz bağlanmanın derecesi.

10

11 Son çıkarılan elektroforez üniteleri –İki tip tampon- pH 8.5 ile pH 6.0

12

13 Proteinlerin Jel Üzerinde Görünür Hale Getirilmesi-Jelin Boyanması
Coomassie Brilliant Blue (CBB) ile boyama Gümüş ile boyama

14 Proteinlerin jel üzerinden membrana transferi
Blotlama için yapılan hazırlıklar Transfer tamponun hazırlanması Jelin Hazırlanması Membranın hazırlanması Semi-Dry Blotlama 7 cm’lik bir jelin transferi için 15V’da 20 dakikalık

15 Sinyal oluşumu ve görüntüleme