Polimerase Chain Reaction

... konulu sunumlar: "Polimerase Chain Reaction"— Sunum transkripti:

1 Polimerase Chain Reaction
Hazırlayan: Bilge Ertekin

2 PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu)
PCR tekniği Cetus firmasının insan genetiği departmanında çalışan araştırmacı Kary Mullis tarafından 1985’te bulunmuş ve patenti alınmıştır. PCR; ilk defa, aynı yıl R. Saiki, K. Mullis ve arkadaşları tarafından orak hücre anemisinin tanısının konulmasında uygulanmıştır. Kary Mullis 1993 yılında bu çalışma ile Nobel ödülünü kazanmıştır.

3 PCR PCR, herhangi bir organizmaya ait genomik DNA’ daki özgül bölgelerin çoğaltılmasını (amplifikasyonunu ) sağlayan basit ama çok başarılı bir invitro DNA sentezi yöntemidir. PCR ile bir genin büyük miktarlarda kopyası üretilebilmektedir.

4 DNA hibridizasyon yönteminde sadece söz konusu materyaldeki mevcut DNA veya RNA moleküllerinin saptanması amaçlanırken PCR’da genetik materyalin çoğaltılmasından sonra varlığı saptanması esas alınır. PCR yönteminin bu özelliği DNA moleküllerinin tanınmasını kolaylaştırır.

5 PCR; DNA’ nın dizi analizi ve DNA haritalamasında
Genetik hastalık teşhisinde ( orak hücre anemisi, kistik fibrozis, fragile X sendromu, AIDS, lösemi v.b. ) DNA parmak analizinde İnsan evrimi araştırmalarında İnsan Genom Projesi’ ndeki araştırmalarda

6 Allellik dizi varyasyonlarının gösterilebilmesi ile doku transplantasyonu için doku tipinin belirlenmesinde Adli tıp örneklerinin genetik tiplendirilmesinde ( analık babalık tayini ) Tarımda ( tohum saflığının belirlenmesi )

7 Sistematik ve evolüsyon çalışmalarında ( doğadaki çeşitli canlı türlerinin tanısı, türler arasındaki polimorfizmin belirlenmesinde ) Hatta Mısır’ daki mumyalardan DNA klonlamasında da kullanılmaktadır.

8 PCR PCR da döngüde tekrarlanan 3 ana basamak vardır. Bu basamaklar reaksiyon karışımını içeren tüpleri kısa bir zamanda ısıtıp soğutabilen otomatik bir dönüştürücü’de (cycler) yapılır. PCR reaksiyonu için gerekenler; deoksinükleotidtrifosfatlar (dATP,dGTP,dCTP ve dTTP), DNA polimeraz primerler, kalıp ve magnezyum içeren PCR tamponudur.

9 PCR’ın 3 basamağı şunlardır;
1) Denatürasyon: Amplifiye edilecek çift iplikçikli DNA zinciri yüksek sıcaklığa (94 C) maruz bırakılarak tek iplikçikli hale dönüştürülür.

10 2) Annealing: Primerlerin DNA’ daki hedef bölgelerle özgül hibridizasyonuna olanak verecek sıcaklıkta annealing reaksiyonu Primerlerin ayrılmış DNA zincirleri üzerinde komplementer oldukları bölgelere eşleşip kalıp DNA zinciri ile primer arasında hidrojen bağlarının oluşmasının sağlanacağı bir sıcaklık derecesi vardır.

11 Tm ( erime noktası ) adını alan bu sıcaklık derecesi primer dizisinin baz içeriğine göre değişir. Primerdeki G ve C sayısı artıkça Tm derecesi de artar. Tm = 4 ( G + C ) + 2 ( A + T ) Annealing sıcaklığı genellikle Tm değerinin 5 C aşağısı alınarak belirlenir.

12 3) Extension: 72 C Taq polimeraz enziminin ideal çalışma sıcaklığıdır. Bu sıcaklıkta primerler uzar ve tamamlayıcı zincir sentezi olur.

13

14 Reaksiyonun özgülüğü çok iyi tanımlanmış primer oligonükleotidlerin ( nükleotidden oluşan ) seçilmesiyle sağlanır. Bunlar amplifiye edilecek DNA’ya bağlanacak olan bağlanma bölgesine komplementer yapıda kısa tek sarmal DNA molekülleridir. Primerler çiftler halinde biri çift zincir DNA’yı oluşturan zincirlerinden birine, diğeri de o zincirin komplementerine eşleşecek şekilde farklı dizilimlerde tasarlanır. Amplifikasyon için DNA dizisinin bilinmesi gerekli değildir. Birleşme bölgelerinin dizisinin bilinmesi yeterlidir.

15 Reaksiyon için ısıya dayanıklı bir enzim Taq DNA polimeraz Klenow fragmenti kullanılırken, günümüzde “Thermus aquaticus” termofilik bakterisinden izole edilen ve ısıya dayanıklı enzim Taq polimeraz kullanılmaktadır. Çünkü bu enzim 94 C de inkübe edildikten sonra bile aktivitesini kaybetmez. Oysa E-coli den elde edilen DNA polimeraz I yüksek sıcaklıkta inaktive olur ve her cycle enzimi yenilemek gerekir.

16 DNA polimeraz enzimleri bir DNA sentezleyebilmek için komplementerini sentezleyeceği bir kalıp DNA molekülüne, substrat olarak dNTP’ lere ve kalıp zincirine eşleşmiş primerin 3 OH grubuna ihtiyaç duyarlar.

17 PCR için saf DNA kullanılmaya gerek yoktur
PCR için saf DNA kullanılmaya gerek yoktur. Kaba hücre özütü, total DNA preparatı, bir damla kan ya da sperm başarılı bir PCR için başlangıç materyali olabilir.

18 Enzim bu bileşenlerin bir araya geldiği uygun tampon sisteminde ve uygun sıcaklıkta primerin 3 OH grubuna serbest dNTP’ lerin 5a -fosfat gruplarını fosfodiester bağı ile kovalent olarak bağlar.Tamponlar, enzim için gerekli olan elektrolitleri ve koenzimleri sağlar. Yine polimeraz enzimleri aktiviteler için serbest magnezyum iyonlarına gereksinim gösterir.Bu yüzden magnezyum içeren tamponlar kullanılır.

19 Başlangıçtaki DNA molekülü sayısı PCR’ ın kaç döngü uygulanacağını belirler. 1 – 100 kopya DNA molekülü ile başlanıyorsa 30 – 45 döngü, – ile başlanıyorsa 20 – 30 döngü yeterlidir. Bir döngü sonucunda başlangıçta n olan DNA zincir sayısı 2 n’ e yükselir. Döngüler arka arkaya çok kez tekrarlanırken herbir döngünün ürünü, bir sonrakinde kalıp olarak kullanıldığı için her döngüde istenen DNA segmentinin miktarı 2 katına çıkar.

20 Bu şekilde kez tekrarlanan reaksiyonlar zinciri sonucunda örnekte başlangıçta belki de sadece bir olan DNA sayısı birkaç saat içinde milyon kez çoğalarak hibridizasyon yöntemlerinden biriyle işaretli prob DNA yardımıyla kolayca saptanabilir.

21 Hedef genetik materyalin, RNA virüslerinde olduğu gibi, RNA molekülü olması durumunda ise önce revers trnskriptase enzimi kullanılarak RNA molekülüne komplementer DNA (c DNA) molekülü sentezlenir. C DNA iplikçiği RNA iplikçiğinden ayrıldıktan sonra DNA polimeraz 1 enzimi kullanılarak c DNA iplikçiğine komlementer DNA iplikçiği sentezlenir ve molekül çift sarmal DNA molekülüne dönüşür. Bu aşamadan sonra PCR aşamaları takip edilerek DNA molekülü çoğaltılır.

22

23 Bazı durumlarda DNA sarmalları arsında stabil sekonder yapı oluşabileceği için DNA çoğalması gerçekleşmeyebilir. Örneğin çoğaltılacak olan bölgenin G-C oranı yüksekse bu olabilir. Döngü sayısı arttıkça hem enzimin tanıması gereken DNA moleküllerindeki artış hem de tekrar tekrar ısıtma sonucu enzim aktivitesinde düşüş nedeniyle verim düşmektedir.

24 Buna ilaveten ısıya dayanıklı olmayan enzim kullanılmışsa her döngüde ortama ilave edilen enzim reaksiyon ortamını değiştirerek enzimin katalitik aktivitesini etkilemektedir.

25 PCR, çok duyarlı bir yöntem olmakla birlikte bu yöntemde farklı kaynaklardan gelen DNA moleküllerinin test ortamını kontamine etmesi söz konusu olabilmektedir. Bunun sonucunda reaksiyonda hedef mikroorganizmaya ait olmayan DNA moleküllerinin de çoğaltılması hataya neden olmaktadır. Bu tip bir DNA kontaminasyonunun önlenmesi amacıyla reaksiyon karışımının steril şartlarda hazırlanması gerekmektedir.

26 Teşekkürler…