Hippo sinyal iletim sistemi üyesi Yes Associated Protein 1’in prostat kanseri gelişimindeki rolünün araştırılması Ümmühan Demir¹, Fatma Sağır² ve Filiz Kısaayak Çollak² ¹Sakarya Üniversitesi, Sağlık Hizmetleri Meslek Yüksekokulu, Sakarya, Türkiye ²İstanbul Medeniyet Üniversitesi, Fen Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, İstanbul, Türkiye 1. Yap ve pYAP miktarının prostat kanseri hücre hatlarında incelenmesi Figur 1. Belirtilen hücre hatlarından hücre lizatları elde edilerek western blotlama yapılmıştır. 2 .YAP1 ve pYAP1in sitoplazmik/nükleer dağılımlarının incelenmesi Figür 2: Belirtilen hücre hatlarında sitoplazmik/nükleer fraksiyonlar izole edilerek pYAP1 ve YAP1 miktarı western blotlama ile incelenmiştir. 3. YAP1in siRNA ile susturulması ve proliferasyona etkisinin incelenmesi Figür 3: YAP1 mRNAsına spesifik siRNAlar kullanılarak belirtilen hücre hatlarında YAP1 susturulmuştur. Figür 5: PC3 hücre hattına siRNA uygulandıktan 72 saat sonra hücreler sayılmıştır. YAP1 siRNA uygulanan hücrelerde, hücre sayısı anlamlı şekilde düşük olduğu görülmüştür. YAP1in overeksprese edilerek fonksiyonel analizler yapılması YAP1in AR için koaktivatör olarak görev yapmasının incelenmesi YAP1 miktarının prostat kanseri doku örneklerinde incelenmesi 4. YAP1in susturulmasının monolayer koloni oluşturmaya etkisinin incelenmesi Figür 6: PC3 hücrelerine 48 saat arayla 2 kez siRNA uygulanmıştır. 72 saat sonunda hücreler 10 cmlik petri kaplarına ekilmiştir.15 gün sonunda sabitlenerek boyanmıştır. Figür 7: Boyanan koloniler sayılarak grafik oluşturulmuştur. YAP1 siRNA uygulanan hücreler anlamlı şekilde daha az koloni oluşturmuştur 5. YAP1in susturulmasının soft agar koloni oluşturmaya etkisinin incelenmesi Figür 8: PC3 hücrelerine 48 saat arayla 2 kez siRNA uygulanmıştır. 72 saat sonunda hücreler agarla karıştırılarak 6-kuyucuklu kültür kaplarına ekilmiştir. 15 gün sonunda mikroskopta incelenmiştir. YAP1 siRNA uygulanan hücrelerin daha az ve daha küçük koloniler oluşturduğu gözlemlenmiştir. 6. YAP1 ve AR proteinlerinin ilişkisinin incelenmesi Figür 9: PC3 hücrelerinde YAP1 ve Androjen reseptörü(AR) overeksprese edilmiştir. 48 saat sonra örneklere CoIP tekniği uygulanmıştır. AR ve YAP1 proteinleri birbirine bağlanmaktadır. . İncelenen prostat kanseri hücrelerinde YAP1 protein miktarı AR pozitif LNCaPlerde AR negatif PC3lerden azdır. YAP1 hem sitoplazma hem de nükleusta yerleşiktir, pYAP1 ise sitoplazmada tespit edilmiştir. YAP1in susturulması PC3 hücrelerinde proliferasyon, monolayer ve soft agar koloni oluşturma kapasitesini azaltmıştır. YAP1 AR ile protein kompleksi oluşturmaktadır. Giriş Bulgular Yes associated protein 1(YAP1), Hippo tümör baskılayıcı sinyal yolağının bir üyesidir. Bu yolak, hücre çoğalması, apoptoz ve organ büyüklüğünün düzenlenmesi gibi birçok hücresel olayda görev almaktadır. YAP1 bu yolağın sonunda yer alarak transkripsiyonel koaktivatör olarak görev yapar. Hippo sinyal iletim yolağı aktif olduğunda fosforile YAP1 inaktif olarak sitoplazmada bulunur. YAP1 aktive olarak nükleusa geçtiğinde hücre çoğalması ve canlılığı ile ilgili genleri düzenler. YAP1 Hippo yolağı dışında da birçok hücresel yolakla birlikte çalışmaktadır. YAP1’in birçok kanser türünde deregüle olduğu gösterilmiştir. Ancak YAP1in prostat kanserindeki rolü henüz tam aydınlatılamamıştır. Prostat kanseri hücre hatları (LNCaP, PC3) ve normal prostat epital hücreleri (PrPec) kullanılmıştır.Tüm hücre lizatları ve sitoplazmik/nükleer fraksiyonlar elde edilmiştir. Sitoplazmik/nükleer fraksiyonların eldesi için nükleer ekstraksiyon kiti (Affimetrix) kullanılmıştır. YAP1 ve pYAP1 spesifik antikorlar kullanılarak western blotlama yapılmıştır. Hücrelerde YAP1 proteini, YAP1 mRNAsına özgül siRNAlar (Dharmacon) kullanılarak susturulmuştur. Takiben proliferasyon analizi (MTS ve hücre sayısı), koloni formasyon ve soft agar koloni formasyon gibi fonksiyonel analizler uygulanmıştır. Ayrıca protein-protein etkileşimlerinin tesbiti için ko-immünopresipitasyon (CoIP) yöntemi kullanılmıştır. 1. Aranda-Orgilles B, Aigner J, Kunath M, Lurz R, Schneider R, Schweiger S (2015). The mammalian Hippo pathway: regulation and function of YAP1 and TAZ. Cell Mol Life Sci,72(2)Ç285-306 2. .Moraishi T. Hansen CG, Guan KL (2015). The emerging roles of YAP and TAZ in cancer. Nature Reviews Cancer: 15:73-79. . Çalışmanın amacı: Prostat kanseri hücre hatları kullanılarak YAP1 molekülünün prostat kanseri gelişimindeki rolünün araştırılması Materyal-Metot Figür 4: LNCaP ve PC3 hücrelerine YAP1in susturulmasından 72 saat sonra MTS uygulanmıştır. YAP1 siRNA uygulamasının iki hücre hattında da proliferasyonu azalttığı görülmüştür. Sonuçlar Kaynakça Hedefler Bu çalışma Tübitak tarafından desteklenmektedir. 3501-Kariyer geliştirme projesi 114S419 Ummuhandemir@sakarya.edu.tr