Jurkat T Hücrelerinden Efektör Th17 Oluşturulması Sena Atıcı1, Büşra Korkmaz1, Ayten Nalbant 1 1 Moleküler İmmünoloji Laboratuvarı, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü, Urla, İzmir 35430, Türkiye GİRİŞ Jurkatlarda Transkripsiyon Faktörlerinin Ölçümü Jurkat hücreleri Th17 hücrelerine farklılaşmaları sırasında RORC2 ve STAT3 transkripsiyon faktörleri ifade edilir. CD4+ yardımcı hücreleri periferde bulunan naif T hücrelerinin bir grubudur. Bulundukları mikroçevrede antijenler ve sitokinler T hücrelerinin alt gruplarına farklılaşmasına neden olurlar. Naif CD4 T lenfositleri IL-23, IL-1β, CD3, CD28 varlığında Th17 hücrelerine dönüşürler (Figür 1). Th17’ler IL-17,IL-22, CCR6 gibi molekülleri ve STAT3, RORC2 transkripsiyon faktörlerini üretirler (1). Th17 hücreleri Multipl Skleroz, Romatoid Artrit, Tip 2 Diyabet gibi otoimmün hastalıkların patogenezinde,kanserde ve inflamasyon kökenli patolojilerde önemli rol oynamaktadırlar (2). PMA (Forbol miristat asetat) ile I (iyonomisin), antijen spesifik olmayan etki ile Jurkat hücrelerinin aktivasyonunu in vitro olarak sağlar. PMA bir forbol esterdir ve protein kinaz aktivasyonunu sağlamaktadır. I bir kalsiyum iyonoforudur ve kalsiyum salınımını sağlar. Kalsiyum ise NFAT yolağını aktive eder (figür2) (3). Amaç Literatürde Th17 hücreleri antijen ve spesifik sitokinler içeren mikroçevrede in vitro olarak oluşturulmaktadır. Bu primer hücrelerden pahalı ve uzun süren kültür çalışmalarıyla elde edilmektedir. Bu çalışmada ise spesifik antijen ve farklı sitokin kombinasyonu kullanılmadan Jurkat hücrelerinden Th17 üretimi amaçlanmıştır ve bu amaçla PMA/I kullanılmıştır. Figür 4: CD3’e karşı RORC2 oranları 3., 5. ve 7. günlerde gözlemlenmiştir. Zamana göre RORC2 oranları kontrol grubu için 2.56, 0.24; 25ng stimüle edilmiş hücreler için 6.53, 6.28; 50ng stimüle edilmiş hücreler için 5.69, 6.48 olarak ölçülmüştür. Figür 1: CD4+ T hücrelerinin Th17’lere farklılaşmasında rol alan in vitro faktörler (1) Laboratuvar koşullarında, PMA, iyonomisin, LPS, IL-1β ile CD3 antijen olmadan Th17 aktivasyonunda rol alırlar. Tablo 1: CD3’e karşı STAT3 transkripsiyon faktörünün 7. günde ölçülen oranları gösterilmektedir. Hücre grubu STAT3 oranı Control 0,22 25ng stim. 6,78 50ng stim. 6,00 7. Günde STAT3 oranı kontrol grubunda 0.22; 25ng stimüle edilmiş hücrelerde 6.78 ve 50ng stimüle edilmiş hücre grubunda 6.00 olarak ölçülmüştür. Figür 2: PMA/I’nin T hücreleri aktivasyonu sırasında rol aldığı sinyal yolağı (2) İyonomisin kalsiyum salımını sağlamaktadır. PMA PKC’yi aktive eder. PMA/I birlikte NFAT yolağını etkilerler. Jurkatlarda Apoptotik Markörlerin İfadesi 7AAD ve Fas markörleri hücrelerdeki ölüm oranını göstermektedirler. a) b) YÖNTEM Hücre Kültürü Jurkat hücreleri kültüre edilerek PMA/I ile stimüle edildi. 25ng/µl ve 50ng/µl olmak üzere iki farklı PMA konsantrasyonu kullanıldı. I konsantrasyonu ise 1ng/µl’dır. Th17 Hücrelerinin Fenotipinin Karakterize Edilmesi Jurkat hücrelerin aktivasyonu Fas, CD25 ve CD69 moleküllerinin ifadesiyle ve Th17 fenotipine farklılaşmaları ise RORC2 ve Stat3 transkripsiyon faktörleriyle ölçülmüştür. 7AAD markörü ise ölüm oranlarının ölçümünde kullanılmıştır. Markörler için immunoflorasan hücre boyaması yapıldı. RORC2 için hücre içi boya metodu kullanılırken diğer markörler için yüzey boyaması yapıldı. Veri Analizi Akış sitometrisinin sonuçları MilliporeGuavaSoft2.7 ile analiz edildi. Sonuçlar Microsoft Excel uygulamasına aktarıldı ve örnekler 3 biyolojik replika olduğu için ortalamaları, standart sapmaları hesaplandı. İstatistiksel analiz için örnekler çift kuyruklu t teste tabi tutuldu. P değeri 0,05’e eşit ve küçük olan değerler kullanıldı. Figür 5: CD3’e karşı 7AAD ve FAS oranları 3., 5. ve 7. günlerde gözlemlenmiştir. a) Zamana göre 7AAD oranları kontrol grubu için 0.45, 0.71, 0.32; 25ng stimüle edilmiş hücreler için 10.60, 0.21, 0.64; 50ng stimüle edilmiş hücreler için 8.48, 1.01, 1.41 olarak ölçülmüştür. b) Zamana göre FAS oranları kontrol grubu için 5.00, 13.39, 2.94; 25ng stimüle edilmiş hücreler için 34.26, 14.72, 14.96; 50ng stimüle edilmiş hücreler için 12.90, 14.70, 18.36 olarak gözlemlenmiştir. TARTIŞMA Elde edilen veriler analiz edildiğinde, stimülasyon grupları kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, tüm gruplardaki CD25 oranındaki artış %13 ifadesini geçememiştir. Fakat CD69 oranı 5. ve 7. günlerde yaklaşık %50’lere ulaşmıştır. CD69 aktivasyon markörü CD25 ifadesinden daha güçlüdür (Figür 3). 5. ve 7. günlerde CD25 ifade eden aktif Jurkat hücrelerinin RORC2 ve STAT3 ifadeleri %7 civarındadır. RORC2 ve STAT3, Th17 farklılaşması sırasında ifade edildiğinden aktive olan Jurkatların Th17 fenotipine polarize olma eğiliminde oldukları gözlenmiştir (Figür 4, Tablo 1). Literatürde Th17 olan efektör T hücrelerinin Fas ifade ettikleri belirtilmiştir. Dolayısıyla, Jurkat hücrelerinde Fas ifadesi ölçülmüş: 3. Günde 25ng PMA ile stimüle edilmiş hücrelerde Fas yüzdesi diğer günlere ve 50ng ile stimüle edilmiş hücrelerden daha fazladır (Figür 5). Efektör Th17’lerde fas artışı apoptoz, kalsiyum salınımını ve PKC’nin aktivasyonu ile ilintilendirilmekle birlikte Fas’ın apoptotik olmayan görevleri de vardır. (4). Bu nedenle Fas ifade artışının fonksiyonunun detaylıca araştırılması gerekmektedir. Ayrıca, Jurkat hücrelerinin aktivasyon oranını artırarak daha fazla Th17 yapmak planlanan çalışmalar arasındadır. Bunu yapmak adına kültür koşullarına IL-2, değişen konsantrasyonlarda glikoz eklenerek deneyler tekrarlanacaktır. Sunulan çalışmanın temel sonucu, Jurkat hücrelerinin PMA/I stimülasyonu sonucunda, hücrelerin aktive olduğu, aktive olan hücrelerin RORC2 ve Stat3 gibi transkripsiyon faktörlerini ifade ettikleri tespit edilmiştir. Bu veriler aktive olmuş Jurkat hücrelerinin Th17’ye farklılaşma kapasitesinde olduğunu göstermektedir. Bu çalışma Dr. Ayten Nalbant’ın 2016İYTE20 nolu BAP projesi kapsamında desteklenmiştir. SONUÇLAR Jurkatlarda Aktivasyon Markörlerinin İfadesi Aktive olan jurkat hücreleri CD25 ve CD69 ifade ederler. a) b) KAYNAKLAR Identification of Novel Cell Surface Markers on Mouse and Human Th17 Cells: R&D Systems. (2017). [online] Rndsystems.com. Available at: https://www.rndsystems.com/resources/posters/identification-novel-cell-surface-markers-mouse-and-human-th17-cells [Accessed 19 Feb. 2017]. Maddur, M.S., Miossec, P., Kaveri, S., Bayry, J. Th17 Cells : Biology, Pathogenesis of Autoimmune and Inflammatory Diseases, and Therapeutic Strategies. The American Journal of Pathology. 181(1). pp. 8-18. Bell, C. (2002) T-cell turn-off. Nature Reviews Immunology 2, 460 . doi:10.1038/nri863 Sen, C., Sashwati, R. and Packer, L. (1999). Fas mediated apoptosis of human Jurkat T-cells: intracellular events and potentiation by redox-active α-lipoic acid. Cell Death and Differentiation, 6(5), pp.481-491. Figür 3: CD3’e karşı CD25 ve CD69 oranları 3., 5. ve 7. günlerde gözlemlenmiştir. a) Günlere göre CD25 oranları kontrol grubu için 1.64, 3.58, 0.15; 25ng stimüle edilmiş hücreler için 8.77, 12.45, 9.88 ve 50ng stimüle edilmiş hücreler için 7.00, 11.46, 6.85 olarak ölçülmüştür. b) CD69 için bu oranlar kontrol grubunda 0.33, 2.3, 0.68; 25ng stimüle edilmiş hücrelerde 16.45, 52.93, 53.54; 50ng stimüle edilmiş hücrelerde 17.32, 51.23, 67.64 olarak gözlemlenmiştir.