Çukurova Bölgesi’ndeki Konjenital Adrenal Hiperplazi’li Hastalarda 21‑Hidroksilaz Enzim Eksikliklerine Yol Açan Mutasyonların Analizi Ebru DÜNDAR YENİLMEZ1, Duygu DÜZGÜNCE BOĞA1, Abdullah TULİ1, Bilgin YÜKSEL2 1 Çukurova Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı, Adana 2 Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi, Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı, Çocuk Endokrinoloji Bilim Dalı, Adana edundar@cu.edu.tr GİRİŞ Konjenital adrenal hiperplazi (KAH) adrenal kortekste, kortizol sentezi için gerekli olan enzimlerden birinin eksikliğine bağlı olarak gelişen ve otozomal resesif kalıtımla geçen, genetik, endokrin ve metabolik bir hastalıktır1. Hastalığın en yaygın formu, 21-hidroksilaz enzim eksikliğidir. 21-hidroksilazı kodlayan gendeki (CYP21) spesifik mutasyonlara bağlı olarak üç ana hastalık fenotipi bulunur. Bu çalışmada, Çukurova Bölgesi’ndeki Konjenital Adrenal Hiperplazi’li hastalarda 21‑Hidroksilaz Enzim Eksikliklerine yol açan mutasyonların PCR, restriksiyon enzim analizleri gibi klasik yöntemlerin yanı sıra heterodubleks analiz ve otomatik DNA dizi analizi yöntemleri de kullanılarak belirlenmesi ve Çukurova özelinde Türkiye hakkında prenatal tanı çalışmalarına olanak sağlayacak gen havuzunun ve mutasyon sıklığının saptanması ve Çukurova bölgesine özgü 21-hidroksilaz eksikliği sıklığının tanımlanması amaçlanmıştır. Tablo 1. Hastalarda saptanan mutasyonların allel sıklığı ile her bir klinik tipe ait mutasyon sıklığı Şekil 2. CYP21 geni Ekson 1’de saptanan H62L (A→T) mutasyonunun dizi analizi görüntüsü TARTIŞMA Çukurova Bölgesi’nde, KAH’li hastalarda 21-Hidroksilaz enzim eksikliğine yol açan mutasyonların analizi 91 hastada gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma, Türkiye’de Çukurova Bölgesi’ndeki 21-Hidroksilaz eksikliğine yol açan mutasyon dağılımını gösteren ilk çalışmadır. Türkiye’de rastlanan en sık mutasyon olduğu bildirilen IVS2 mutasyonu çalışmamızda sıklığı %32,9 olarak saptanmıştır. V281L mutasyonu sıklığı bizim çalışmamızda %17,0 sıklıkla saptanmış olup literatürle uyumludur. Bunun yanında I172N mutasyon sıklığı, Q318X mutasyonu sıklığıyla Japonya’daki gibi sık saptanan mutasyonlar arasında olması da Türk toplumunun bir diğer özelliği sayılabilir. Çalışmamızda dizi analiziyle alellerin %4,9’unda Türkiye’de sık rastlanmayan H62L mutasyonu belirlenmiştir. H62L mutasyonu Fransa’da yapılan bir çalışmada da tanımlanan 60 yeni mutasyon arasında en sık rastlanan mutasyon olarak belirtilmiştir. Çalışmamızda yine %16,4 sıklıkla görülen mutasyon dizi analizi yöntemiyle saptanan R356W mutasyonudur. Bu çalışma sonucunda KAH hastalığının Çukurova bölgesinde görülme sıklığı ve gen çeşitliliği hakkında bilgi sahibi olunmuş ve böylelikle bölgeye ait mutasyonların tespit edilmesi ile hedeflenen prenatal tanıda kullanılacak gen repertuvarı belirlenmiştir. Bu çalışmalar sayesinde prenatal çalışmalara olanak sağlayacak gen havuzu oluşturularak KAH nedeni moleküler olarak tanımlanmış ailelere erken prenatal tanı yapılması mümkün olacaktır. MATERYAL ve METOD Çukurova bölgesinden, Ç.Ü. Pediatrik Metabolizma-Endokrinoloji Bilim Dalı’na başvuran, 21-hidroksilaz enzim eksikliği kabul-red kriterlerini sağlayan toplam 100 hasta çalışmaya alınmıştır. Hastalardan EDTA’lı tüpe alınan 5 mL kandan, DNA izole edilmiştir. Sık görülen CYP21 mutasyonları için restriksiyon enzim analizi (REA) yapılmıştır. Ekzon 1’de P30L, intron 2’de (IVS2-13A/C→G), splice bölge mutasyonu, ekzon 4’de I172N, ekzon 6’da 3 mutasyon kümesi (I236N, V237E, M239K), ekzon 7’de V281L, ekzon 8’de Q318X stop kodon mutasyonu için sırasıyla, AciI, AluI, BsrI, NdeII, BsiHKAI, ve PstI enzimleri kullanılmıştır. REA analizi ile belirlenemeyen mutasyonlar için heterodubleks analiz ile mutasyon bölgesi belirlenip o bölgeye DNA dizi analizi yapılmıştır. SONUÇLAR 21-hidroksilaz enzim eksikliği kriterini sağlayan 91 hastada yapılan PCR ve REA analizleri sonucunda,138 alelde %75,8 sıklıkla mutasyon saptanmıştır. Şekil 1. Intron 2 (A/C→G) Mutasyonu enzim kesimi jel görüntüsü 1. Marker; 2. Heterozigot; 3. Homozigot; 4. Normal. REFERANSLAR 1. Baş F, Kayserili H, Darendeliler F, Uyguner O, Hülya G ve ark . CYP21A2 Gene Mutations in Congenital Adrenal Hyperplasia: Genotype-phenotype correlation in Turkish children J Clin Res Ped Endo 2009;1(3):116–128. 2. New MI and Betensky B. (2004). 21-Hydroxylase Deficiency. Erişim: www.genetests.org 3. Tukel T, Uyguner O, Wei JQ, Yuksel-Apak M, Saka N, Song DX, Kayserili H, Bas F, Gunoz H, Wilson RC, New MI, Wollnik B. (2003). A novel semiquantitative polymerase chain reaction/enzyme digestion-based method for detection of large scale deletions/conversions of the CYP21 gene and mutation screening in Turkish families with 21-hydroxylase deficiency. J Clin Endocrinol & Metab,88(12):5893-7. 4. White PC, Tusie-Luna MT, New MI, Speiser PW. Mutations in steroid 21-hydroxylase (CYP21). Hum Mut 1994;3:373-378. Bu çalışma Tübitak tarafından desteklenmiştir. Proje No: 108S236