Tek Embryo Transferinde IVF laboratuarının önemi Dr. Tuğçe Pehlivan Budak

Niçin çok embriyo transfer edilir(di)? Merkez ve çift açısından açısından IVF’de başarı oranının istenilen düzeyde olmaması Transfer edilen embriyoların gelişimi ve implantasyon potansiyeli hakkında yetersiz bilgi Dondurma programı başarısı düşük Çoğul gebelik hakkında yetersiz bilgilendirme İkiz gebelikler: çiftler açısından olumlu karşılanıyor. Embriyo redüksiyonu (sonlandırma) – Düşük riski – Psikolojik travma

Transfer edilen embriyo # 3. gün5. gün 1 embriyo%7.2%8.9 2 embriyo%32.8% embriyo%35.4% ve üzeri%4.6%5.7 Transfer edilen embriyo sayısı – SART 2006

Karlström et. al. Hum Reprod 2007 Birth rate and MBR in relation to the percentage of SET and triple embryo transfer (TET) in Sweden 1991–2004

Cochrane Review Tek embryo transferi artık bazı ülkelerde zorunludur. Cochrane Review: – Tek embryo transferinin çoğul gebelik oranlarını ve fresh siklüslerdeki canlı yenidoğan oranlarını azaltıyor. – Ancak, dondurulmuş embryo transferi sonrası oluşan gebelik oranlarının 2 embryo transferiyle aynı başarıyı verdiğini göstermiştir. Pandian et., 2005 – Yapılan randomize çalışmalar tek embryo transferinin ve çift embryo transferinin benzer kumulatif gebelik oranları sağladığını göstermiştir Thurin et al. 2004; Lukassen et al., 2005

Single embryo transfer policy ESHRE guidelines Single embryo transfer (SET) in selected groups of patients is advocated as the only effective means of lowering the rate of twin pregnancies. The transfer of one good quality embryo from at least two available can reduce the twin pregnancy rate significantly. The implementation of elective SET is possible only in combination with high quality laboratories and good cryopreservation programmes.

Bir merkezin kalite ve başarısını ölçen kriterler nelerdir? Transfer edilen ortalama embriyo sayısı Elektif SET oranı DET oranı Embriyo dondurma programı başarısı Çoğul gebelik oranı İmplantasyon oranı IR > % 25 (Barri P. Hum. Reprod Update 2005) IR > % 30 (ESHRE 2009)

IVF/ICSI Başarı Göstergeleri “IVI benchmarks” <36 yaş hastalarda, ≥4 oosit, PCO dışı vakalar IVF Fertilizasyon oranı> % 60 IVF Total fertilizasyon başarısızlığı< % 3 ICSI Fertilizasyon oranı> %75 ICSI oosit dejenerasyon oranı< % 2 Grade 1 Embryolar (ASEBİR GRADE A&B)% 50 Klinik gebelik oranı ( D2-D6)% 60 İmplantasyon oranı ( D2-D6)% 40 Canlı doğum oranı% 50 8 oosit, ağır male faktör dışı vakalar

IVF’te Başarısızlık Nedir? Gebelik olmaması Biokimyasal gebelik Düşükle sonuçlanması Çoğul gebelikler Anne veya bebeğin sağlığının tehlikeye girmesi

End-point Sağlıklı tekiz gebelik

Yeni yönetmeliğe uyum.... IVF laboratuarının başarısı nasıl arttırılabilir?

Yeni yönetmeliğe uyum 1-2 embriyo transferi nedeniyle hastaların mağdur olmaması için neler yapılmalıdır. Özellikle IR< %30 ise Laboratuar koşulları yükseltilmelidir Optimal laboratuar altyapı ve ortam koşulları Optimal embriyo kültür koşulları Efektif embriyo seçimi uygulanması Optimal dondurma programı Personel yetiştirme ve sürekli eğitim Kalite kontrol yönetimi

IVF’te Başarıyı Etkileyen Faktörler Hasta bağlı faktörler: biyoloji Klinik faktörler: stimulasyon protokolleri, OPU, ET teknikleri, luteal destek Ortama bağlı faktörler (makro): laboratuar koşulları, havalandırma, çevre Ortama bağlı faktörler (mikro): Isı ve pH Ekipman: kalibrasyon ve bakım Materyal: plastik, kültür medyumları Metod: uygun metodun seçimi ve doğru uygulanması Ekibin eğitimi: uluslarası normlara uygun eğitim uygulanması Hatalar Kalite kontrol

Stimulasyon Protokolleri ve Oosit/ Embryo Kalitesi

Catherine Racowsky1,3, Bogdan Orasanu1, Miguel J Hinrichsen1,2, Elizabeth S Ginsburg1 1Department of Obstetrics and Gynecology, ASB 1+3, Room 082, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, 75 Francis Street, Boston, MA 02115, USA; 2German Clinic Bad Muender, Centre for Reproductive Medicine, Hannoversche Str. 24, 31848, Bad Muender, Germany 3Correspondence: Fax: ; Embryo quality based on ovulation induction: defining the differences RBMOnline - Vol 11. No –25 Reproductive BioMedicine Online; on web 6 June 2005

Recombinant vs Urinary FSH Significantly higher mature oocyte index 82.1% vs 78.4% Significantly higher arrest at 4 cell 24.8% vs 28% Percentage of embryos of at least 8 cells 32.1% vs 29.9% No differences in fragmentation Number of embryos transferred 3.12±1.18 significantly lower with rec- hFSH Significantly higher implantation rate 19.1 % vs 15.6% Delivery rate per started cycle not significantly different 36.3 % vs 33.2% Significantly more embryos for freezing 6.5 vs 4.4 Cumulative out comes: Significantly higher implantation rate IR 18.7% vs 15.7% Clinical pregnancy rate per started cycle not significantly different 44.1% vs 43.6% Delivery rate not significantly different 37.9 vs 35.5% not-significantly

Recombinant vs Urinary FSH Increased oocytes retrieved with Rec-hFSH, Schats, 2000 No statistical differences but majority show improved outcome with Rec-hFSH, Out, 1996 Increased pregnancy rates with Rec-hFSH ( 22.9% vs 17.9%), Out, 1997 Meta analysis : 12 trials- Daya and Gunby, 1999 – Increased pregnancy rates with Rec-hFSH (30.3% vs 26.1%) Meta analysis: 18 trials- Daya and Gunby, 2004 – Increased pregnancy rates, RCT- Hoomans, 1999 – Higher development rate, more embryos for freezing, – No difference in PR,

FSH vs FSH/LH : Marrs, et al 2003 <35 years old: 9.3 vs 8.3 oocytes(significant), IR: 30.7% vs 23.5% > 35 years old: 10.7 vs 11 IR: 15.7 % vs 21.7% Similar pregnancy rates > 35 years old: increased implantation rates İmplantation rate increased in a subgroup of patients with highest endogenous LH concentrations ( > 1.99 IU/l)

FSH vs hMG: Oocyte and embryo yield and embryo quality significantly higher with the use of r-HFSH vs hMG in GnRH agonist cycles, Balasch et al 2003

Laboratuvar koşulları

Ideal çalışma koşulları Laboratuar altyapısı Kültür koşulları Kalite Kontrol Personel

Amaç Daha iyi laboratuvar koşulları Daha kaliteli embriyolar Daha iyi klinik sonuçlar (PR, IR, Düşük oranı)

Laboratuar koşulları – Partikül sayısı/m 3 – VOC – Mikrobiolojik ajanlar – Sürekli aynı ısı – Sürekli aynı nem oranı Düzenli kontroller yapılmalıdır.

“Cleanroom” classification

Laboratuar ekipmanı

Laboratuar Ekipmanı ASEBİR KRİTERLERİ EkipmanSayı İnkübatörler* Minimum 2 adet Yıllık her 300 siklus için 1 adet daha- ideali her 150 siklüs için 1 adet kültür inkübatörü * İnkübatör başına maksimum 3 hasta Laminar Flow Hava Kabini* Minimum 1 adet (2 çalışma alanı olan) * Yıllık her 300 siklus için 1 kabin daha Mikromanipülasyon sistemi* Yıllık her 300 siklus için 1 adet bulunan invert mikroskop Kriyodondurucular* Minimum 2 adet; veya özel bir aparat gerektirmeyen alternatif teknikler konusunda laboratuar personelin bilgisi ve tecrübesi var ise, örneğin vitrfikasyon, 1 adet * Her 1000 dondurma işlemi için 1 kriyodondurucu daha tavsiye edilir

İnkübatörler Embriyoların “in vitro” ortamda gelişebilmesi için ısı ve gaz koşullarının sabit olması gerekir: – İnkübatörlerin açılması engellenmeli – İnkübatör sayısı arttırılmalı (ideali 1/hasta) – 2 tip inkübatör ile çalışılmalı: Geçici/Working (OPU, denüdasyon vs.) Gelişim/Culture (inseminasyondan transfere kadar) İnkübatör koşullarının günlük kontrolleri: – Isı, pH, CO2

Isıtılmış yüzeyler Kalite kontrolü: Kullanılan sisteme göre yapılmalı Günlük kontroller

Kültür koşulları

Mikrodamla yöntemi (bariyer, ısının korunması) Erken evre embriyo gelişimi: düşük glukoz konsantrasyonu Geç evre embryo dönemi: Yüksek glukoz konsantrasyonu Isı, pH ( batch farkları) ve ışık O 2 kontrollü inkübatörler ( opsiyonel )

Kalite Kontrolü nedir? Bir programın tüm aşamalarının takip edildiği ve her aşamanın kabul edilebilir limitler içerisinde çalıştığının kontrol edildiği bir süreçtir.

Kalite kontrolü nasıl takip edilir ?

Kalite kontrolü – Günlük takipler (ısı, pH, CO2) – Batch kontrolü – Embriyotoksisite testleri – Kültür medyumları – Sarf malzemesi – Fare embriyosu testi – Sperm canlılık testi – IVF lab ve klinik gebelik sonuçlarının takibi-database – Hafta içi – Hafta sonu, tatil günleri – IVF laboratuarının akreditasyonu

Günlük takip ve kayıt Laboratuvar ısı/nem: 20-25ºC / %20-40 Likid nitrojen seviyesi Buzdolabı ısısı: 2-5ºC Termoblok ısısı36,8-37,5C Isıtmalı masa ısısı Kabin yüzey ısısı: 37,0-38,5 ºC ICSI yüzey ısısı37,0-38,5 ºC Inkübatör ölçümleri: Isı ºC CO2 % 5,0-5,5-6,0 (rakım) Su/Vent. pH 7.3  0.5 (haftalık) Pozitif basınç kontrolü CO2 basıncı ve seviye kontrolü Eeejelemeheheheheh Jjflflflflflfl lhihhk

IVF OK Pztsi 05/04/10 Salı 06/04/10 Çrşmba 07/04/ 10 Prşmbe 08/04/10 Cuma 09/04/10 Cmtsi 10/04/10 Pazar 11/04/10 Saat ve isim 09:07 ES/G G 09:05 GG09:10ES 09:12 GG/E S 09:10 GG/E S Isı/ Nem% 1 20 Cº- 40% Isı/ Nem% 2 20 Cº- 40% Isı/ Nem% 3 20 Cº- 40% Basınç +/+/+ Masa-Termo ºC DisplayFlukeDisplayFlukeDisplayFlukeDisplayFlukeDisplayFlukeDisplayFlukeDisplayFluke Gözlemler termo:35.5(9), o.p:36.6(9), y.p:37.8(9) termo:36.0(9), o.p:36.9 (8-9), y.p:37.9 (8-9), 39.0'a kal. termo:36.0 (9), o.p:36.9 (9), y.p:38.1 (9), o.p:36.9 (8-9), y.p:38.8 (8-9) termo:36.0 (9), o.p:37.1 (9), y.p:38.1 (9), o.p:37.5 (8- 9),y.p:38.6 (8-9) termo:36.1 (9), o.p:37.2 (9), y.p:38.0(9) Amel.25 CAmel.26 C.Amel.25 C Masa-Termo ºC DisplayFlukeDisplayFlukeDisplayFlukeDisplayFlukeDisplayFlukeDisplayFlukeDisplayFluke Gözlemler termo:35.6 (5), o.p:36.7 (13) termo:35.5(5), o.p:36.7(13), 37.3'e kal.termo:36.0 (5) termo:36.2(5), o.p:37.7 (13) Placa ICSI ºC DisplayFlukeDisplayFlukeDisplayFlukeDisplayFlukeDisplayFlukeDisplayFlukeDisplayFluke a g Gözlemler Placa ICSI ºC DisplayFlukeDisplayFlukeDisplayFlukeDisplayFlukeDisplayFlukeDisplayFlukeDisplayFluke a g Gözlemler Günlük Kontrolü (Ortam,masa-termo,placa ICSI)

Data toplama

IVF laboratuarının akreditasyonu Auditing İdari işler IVF laboratuarı işlemleri Klinik işlemler IVF laboratuvarı - Aparatların kalibrasyonu - Kalite kontrol yönetimi - İşlemlere ait manualler ( SOPs, Personel eğitim vs.) - Bilgilendirilmiş onam formları ve tarihleri

Personel

IVF Ekibi Jinekologlar Embriyologlar Ekip iyi yetişmiş ve tecrübeli olmalı – Formasyon süreci ve süresi Prosedürler Kalite Kontrol Bilimsel Çalışma

IVF personel sayısı ASEBİR: Her 150 IVF/ICSI siklüsü için 1 embryolog Brussels Free University 2000 OPU/yıl 6 embriyolog, 10 laboratuar teknisyeni Boone and Higdon 2005 Fertil Steril embryolog/ siklüs. Teknisyen: haftada 40 saat Laboratuar Direktörü: haftada 49 saat çalıştığı belirtilmiştir. IVI Valencia (yaklaşık 4000 siklüs/yıl) Her 1000 siklüs için: 5 embriyolog, 4 laboratuar teknisyeni 2 sekreter

FormasyonTecrübe Embriyolog * Biyoloji bilimlerinden mezun olmuş olmalı IVF LABORATUARI: * İnsan fizyolojisi, üreme endokrinolojisi, Minimum 2 yıl tecrübesi ve hücre kültürü ve Yardımcı Üreme 100 siklus ICSI yapmış olmalı Teknikleri hakkında bilgi sahibi olmalı ANDROLOJİ LABORATUARI: IUI için 200 sperm hazırlamış olmalı Bir koordinatör veya formasyonunu tamamlanmış bir başka embriyolog tarafından süpervize edilmiş olmalı Koordinatör Üreme biyolojisine yönelik kurslara IVF LABORATUARI: katılmış olmalı 300 siklus ICSI yapmış olmalı ANDROLOJİ LABORATUARI: IUI için 600 sperm hazırlamış olmalı Lab. sorumlusu Aşağıdaki alanlarda bilgi sahibi olmalı: IVF LABORATUARI: * Üremeyle ilgili tüm konular 500 siklus ICSI yapmış veya * ÜYT ile ilgili ortaya çıkabilecek minimum 2 yıl Koordinatör problemlerin çözülmesi olmuş olmalı * Deney dizaynı ANDROLOJİ LABORATUARI: * Kalite kontrol Minimum 2 yıl koordinatör deneyimi olmalı

Teşekkür ederim