Ders, mikrobiyolojik tanıda serolojik ve moleküler teknikler ile ilgili yapılacak laboratuvar uygulamasının temel bilgilerini vermektedir. Dersin ilk.

... konulu sunumlar: "Ders, mikrobiyolojik tanıda serolojik ve moleküler teknikler ile ilgili yapılacak laboratuvar uygulamasının temel bilgilerini vermektedir. Dersin ilk."— Sunum transkripti:

1 Ders, mikrobiyolojik tanıda serolojik ve moleküler teknikler ile ilgili yapılacak laboratuvar uygulamasının temel bilgilerini vermektedir. Dersin ilk kısmı bugün ve son kısmı gelecek derste işlenecektir.

2 DİKKAT ! Söz konusu laboratuvar uygulaması üç adet pratiğe bölünmüştür. Pratiklerden not alabilmek için her üç pratik çalışmasının hepsine katılmak ve bunlardan türeyen bilgilerle ortak tek adet laboratuvar raporu sunmak gerekmektedir. Üç pratikten bir veya ikisi eksik öğrenci laboratuvar raporu sunamaz, bu nedenle pratiklerin hiçbirinden not alamaz. İlgili duyuru 6. Kurul Yürütme Komitesi tarafından vebe konmuştur. Pratik telafisi TRAKYA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ EĞİTİM-ÖĞRETİM VE SINAV YÖNETMELİĞİ‘nde belirtildiği gibi sadece Üniversite temsili veya YÖK görevlendirmesi durumlarında uygulanır. Bunlar dışındaki mazeretlerde pratik telafisi yoktur. Öğrenci laboratuvara beyaz önlük ve lab defteri ile kabul edilir.

3 Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Mikrobiyoloji Tanı Laboratuvarında Serolojik Testler (immüno teknikler) , Bahar, Trakya Üniv Tıp Fak 6. Kurul, Neşe Akış, PhD, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

4 1 Laboratuvarlar

5 Üniversitemizde Tıp ile İlgili Laboratuvarlar
Araştırma Lab: Tıp Fak., Ecz. Fak., Biyoloji Böl., Kimya Böl., Fizik Böl., Diş Hek. Fak., Bilgisayar Müh. Böl., Genetik ve Biyomüh. Böl., Gıda Müh. Böl., Elektrik-Elektronik Müh. Böl. Hastane Tanı Lab TÜTAGEM Kamu ve Araştırma Hizmet Laboratuvarı Eğitim Lab: Tıp Fak., Ecz. Fak., Biyoloji Böl., Kimya Böl., Fizik Böl., Diş Hek. Fak., Sağ.Bil.Fak., Bilgisayar Müh. Böl., Genetik ve Biyomüh. Böl., Gıda Müh. Böl., Elektrik-Elektronik Müh. Böl., 4 adet Bilgisayar Teknol.Bilişim Sist. Böl., Keşan Sağ.YO, Kırkpınar Bed.Eğ.Spor YO, 2 adet Elektr.Otomas. Böl., Kimya Kim.İşlt.Böl., Veterinerlik Böl., Hemşirelik ve Bakım Hiz. Böl., Sağ.Hiz.MYO

6 Hastanelerde Bulunabilecek Genel Tanı Laboratuvarları
Islak Lab Kuru Lab Genel Hizmet: Merkez Lab (Biyokimya, Mikrobiyoloji, Patoloji, İmmünoloji, Hematoloji, Poliklinik Lab şubesi, Acil Lab şubesi) 2) Özel Lab (Genetik, Farma) Kliniğe Özgü Hizmet: Üroloji, Enfeksiyon, Adli Tıp, Onkoloji, Halk Sağlığı, Kan Banka, Transplantasyon Genel Hizmet: Radyoloji, Nükleer Tıp, Kliniğe Özgü Endoskopi Laboratuvarları, Acil Radyoloji şubesi Kliniğe Özgü Hizmet: Ekokardiyografi, Solunum, Ürodinami, Oftalmolojik Ölçüm, Odyometri, EKG, EMG, EEG, Anjiyografi, Uyku, Egzeris, Fiziksel Tıp, Psikiyatri

7 Tanı Laboratuvarı Personel Çeşidi
Tıbbi uzman (lisans sonrası 3-4 yıllık alan eğitimi) Teknisyen laborant (lisans eğitim) Tekniker laborant (önlisans lab eğitim)

8 Laboratuvarın Hasta/Materyal Kabulü
İstem kağıdında hastanın ön tanısı, varsa tanısı yazılı olmalı Materyalin uygun koşul ve şartlarda nakledilmesine ait bilgiler istem kağıdında yazılı olmalı (materyal saat kaçta alındı, nasıl muhafaza edildi, nasıl gönderildi) Biyogüvenlikle ilgili risk var mı istem kağıdına işlenmiş olmalı (hasta sifiliz, AIDS, EBOLA, vb..)

9 Islak Lab Hasta Materyal Çeşitleri
Kan, serum, plazma Biyopsi örneği Deri veya tırnak kazıntısı, saç Mukozal sürüntü (boğaz, genital, üretral) İdrar, dışkı BAL İrin BOS

10 2 Seroloji

11 Seroloji Tanımı  Hasta materyalindeki antikorlar arasında belirli bir epitopa karşı gelişmiş olanlar aranmak isteniyorsa, özgün antijenine bağlanma reaksiyonu incelenerek belirleme yapılabilir. Bu tekniğe seroloji adı verilir.  Materyalde saptanan antikor miktarı antijen-antikor bağlanma reaksiyonunun şiddet düzeyi ile belirlenebilir.

12 Hasta materyalinde aranabilecek antikorlar
Mikroplara karşı antikorlar Tümör antijenlerine karşı antikorlar Kan grubu antikorları Otoreaktif antikorlar Transplanta reaktif antikorlar Çevresel kimyasalların doku – hücre – plazma molekülleriyle birleşerek oluşturduğu yepyeni yapılara karşı antikorlar (besinler, ilaçlar, inhalanlar, vb…)

13 Vücutta antikor gelişmesi sebepleri
1- Bir antijen ne kadar kompleks yapıda ise immünojenite gücü (yanıt uyandırma kudreti, tehlikeli olma potansiyeli) o derece artar 2- Herhangi bir kimyasal hapten molekülüyle kompleks kurarak immünojenik yapı oluşturabilir

14 Antijen Serolojisi  Hasta materyalinde bir molekül veya antijenin varlığı aranmak isteniyorsa, özgün antikora bağlanma reaksiyonu incelenerek belirleme yapılabilir. Bu tekniğe antijen serolojisi adı verilir.

15 Hasta materyalinde aranabilecek moleküller
Mikrop antijenleri Tümör antijenleri Yanlış katlanmış protein kümeleri (priyonlar, amiloid plaklar, vb..) Plazmada öz moleküller ve hormonlar Dokudaki, hücre yüzeyinde ve içindeki öz moleküller (MHC, vb..) İlaçlar, toksinler Alerjenler Çevresel kimyasalların doku – hücre – vücut molekülleriyle birleşerek oluşturduğu yepyeni yapılar

16 Mikrop Tanısında Seroloji
3 Mikrop Tanısında Seroloji

17 Mikrobiyolojik Tanı Laboratuvar Çeşitleri
Bakteriyoloji Parazitoloji Seroloji Mikoloji Antibiyotik duyarlık TBC Moleküler

18 Seroloji Tekniğinde Prensip
İçinde aradığın olan hasta materyalini al Aradığına bağlanan ligand (antijen/antikor) ile karıştır Aradığın varsa ligandı bağlanır Reaksiyonu görüntülenecek biçimde çoğalt Görüntü var mı? hayır evet Sonuç negatif Sonuç pozitif

19 Reaksiyon bir katı yüzeyine yapıştırılmış ligand ile yürüyor
Reaksiyon sıvı içine eklenen ligand ile yürüyor

20 Presipitasyon Antikor ve antijen
Hepsi birbirlerine çaprazlama bağlanınca ağırlaşarak çöküyor

21 Aglütinasyon Kürecik lateks ise lateks aglütinasyonu, eritrosit ise hemaglütinasyon Hepsi birbirlerine çaprazlama bağlanınca kümeleşerek çöküyor

22 Mikropları kullanarak antikor saptama

23 Lateks partiküllerini antijenle kaplayarak antikor saptama = Lateks aglütinasyonu

24 Eritrositleri antijenle kaplayarak antikor saptama = Hemaglütinasyon

25 Aglütinasyon testi, kullanılan test kabına göre de isimlendirilir
Tüp Agg Mikroplak Agg Lam Agg. (çoklu çukurları olan mini tepsi)

26 Plak hemaglütinasyon testi Bakteri antijeni ile kaplı eritrosit üzerine hasta serumu eklenmiş
Pozitif++ (serum 1/32) Pozitif++++ (serum ½) Pozitif+++ (serum 1/8) Negatif (serum 1/512) Pozitif+ (serum 1/128)

27 Heterofil Antikor Hasta serumunda antikor aramak için testte kullanılan antijen orijinal antijen değilse (taklidi, benzeri, suni, sentetik, vb. ise), test sonucu pozitif sonuç çıktığında heterofil antikor saptandı denir.

28 4 Kan Grubu Tayini

29 Kan grubu tayini Hasta eritrositleri üzerine kan grubu antikoru eklenir Bağlanma varsa eritrositler kümeleşir Lam agglütinasyon testi

30 5 Presipitasyon ve aglütinasyonda hepsi (tüm antijen ve antikorlar) birbirine nasıl çaprazlama bağlanır?

31 paratoplar epitoplar Antijen Presipitasyon ve aglütinasyon, 1 epitopa 1 paratop oranı sağlanırsa gerçekleşir

32 1 epitopa:1 paratop oranı tutturulamazsa çökme/kümeleşme görülmez
HEPSİ BİRBİRİNE BAĞLANMIŞ 1 epitopa:1 paratop oranı tutturulamazsa çökme/kümeleşme görülmez

33 Valens Antijen üzerinde bulunan epitop sayısına o antijenin valensi dir. Antijen Antijen Az valensli antijen Çok valensli antijen

34 Antijen Antikor Serum seyreltmesi 1 epitopa 1 paratop oranı sağlamak için antikor (hasta serumu) seri seyreltilir

35 Serumun seri seyreltilmesi
2 ml 2 ml serum 1: : : : : : : :256 Titre ünitesi: Çok kez seyreltildiği halde hala pozitif kalan serumda antikor yüksek titrededir

36 Bakteri molekülleri + hasta serumu = Ag:Ab oranı 1:1 ise PRESİPİTASYON
Tüpte Plakta Jelde Çökelti gözle izlenebilir Bulanıklık nefelometre cihazı ile ölçülebilir Bulanıksızlık (geçirgenlik) turbitidometre cihazı ile ölçülebilir

37 6 Avidite

38 Avidite= paratop adedi X afinite
10-12

39 Aviditenin klinikte kullanımı
Valensi belirli antijen pozitif hasta serumu ile ve ayrıca afinitesi belli paratopla paralel reaksiyona sokulur. Hasta serumunun bilinen paratopa göre kaç kat fazla reaksiyon verdiği ölçülerek aviditesi ortaya konur. Sadece aviditesi yüksek antikorlar IgM’dir, hastalık yeni başlamıştır (akut). Halbuki afinitesi yüksek antikor durumunda hasta bağışıktır veya latensi mevcuttur. Toksoplazma antikorlarının gebelikte aranmasında sık başvurulur.

40 Antikorun IgM ve IgG olmasının önemi
Akut enfeksiyonda IgM antikoru vardır. IgM yüksek aviditesi nedeniyle hemen aglütinasyon verir. Enfeksiyon takip edildiğinde bir süre sonra IgM'ler IgG'ye dönüşür Bağışıklık veya latent enfeksiyonun nüks durumunda ise hastada özgül IgG antikorları vardır. IgG'nin yüksek titrede olması yakın zamandaki akut enfeksiyon veya nüks belirtisidir.

41 Coombs serumu etkisi ve
7 Coombs serumu etkisi ve pasif agglütinasyon

42 Görüntülenemeyen Agglütinasyon
Düşük seviye ve IgG izotipinde antikor ile aglütinasyon kendiliğinden olmayabilir

43 Görüntülenemeyen Agglütinasyonun Pasif Agglütinasyonla görünür hale getirilmesi
Coombs antikoru (anti insan-Fc antikoru) ile kümeleşmeye yardım edilebilir

44 IgG kümeleri IgM kümelerinden yavaş çöker
Seruma ''Coombs serumu'' eklenirse IgG çökmesi hızlanır ve gözle görünür hale gelir

45 Laboratuvarlarımızdaki Aglütinasyon Testleri
8 Laboratuvarlarımızdaki Aglütinasyon Testleri

46 Mikrobiyal Seroloji Testleri
Testin Adı Mikroorganizma Yöntem Rose-Bengal Brucella Lateks aglütinasyon Wright Tüp aglütinasyon RPR T.pallidum VDRL TPHA İndirek hemaglütinasyon Monospot test EBV Lateks aglütinasyonu Paul- Bunnel Direk hemaglütinason Soğuk Aglütinasyon Mycoplasma pneumonia Direk hemaglütinasyon Gruber- Widal deneyi Salmonella Tüp aglütinasyonu Weil- Felix Riketsiya Ekinokok İHA Echinococcus granulosus

47 Serolojide hata kaynakları
9 Serolojide hata kaynakları

48 Hata nedenleri Serumda fazla lektin varsa (sedimentasyon yüksek) bu küme oluşumunu engellerler. Hasta serumu seyreltilerek bu prozon etkisi bertaraf edilmelidir. Hastada antikor yetmezliği var ise özgül antikor aramak anlamsızdır. Bu nedenle serolojik antikor aranacaksa hastada antikor yetmezliği bulunmadığına emin olmak gerekir. Herpes simpleks virüsüne (HSV) karşı gelişen yanıt sınıfı genellikle IgM sınıfıdır. Bu nedenle IgM saptandığında bunun temasdan sonraki ilk 15 güne mi ait olduğu belirlenemeyebilir, çünkü kişi yıllardır bağışık olduğu halde hafızalı hücreler her temasdan sonra IgM izotipinde antikor üretir. Ayrıca, HSV ailesinin üyeleri ortak epitoplar taşıdıklarından birinde saptanan bir pozitiflik gerçekten o virüse mi özgü emin olmak gerekir veya sonuçların dikkatli yorumlanması gerekir

49 10 Katı faz serolojisi

50 KATI FAZ TEKNİĞİ Katı faz tekniklerinde antijen, katı absorban malzemenin yüzeyini kaplayacak biçimde zemine emdirilir. Antijenle kaplı zemin hasta serumuyla inkübe edilir. Serumda antikor varsa katı faza yapışır. Bağlanmayı görüntülemek için katı faza boya, radyoaktif atom veya renk sağlayıcı enzimle işaretlenmiş anti-insan antikoru eklenir.

51 Enzim Linkli İmmün Sorbeli Test (ELISA)
Birbirlerine bağlanınca sıvı renkli boya ortaya çıkıyor Katı faz, plastik boncuk veya plastik mikroplak çukuriçi

52 İmmün Histokimyasal Test (IHA)
Birbirlerine bağlanınca katı renkli boya ortaya çıkıyor Katı faz, kesit alınmış doku parçası

53 İmmün Floresans Test (IFA, floresans mikroskopi)
Son ayıraç floresans boyalı, bağlanıyorsa orada bağlı kalıyor Katı faz, kesit alınmış doku parçası

54 Akan Hücre Ölçümü ile Antijen Ölçümü
Katı faz lökositlerin kendisidir Anti-CD antikoru floresans boyalı Flow Cytometry Antikor lökosit yüzeyine bağlı kalıyorsa sonuç pozitif (hastada aranan CD’yi içeren lökosit var, örneğin CD4+ T gibi)

55 Rradyo İmmün Test (RIA)
Son ayıraç radyoaktif, bağlanıyorsa orada bağlı kalıyor Katı faz, plastik boncuk veya plastik mikroplak çukuriçi

56 immün Elektron Mikroskopi (IEM)
Antijen serolojisinde antikor altın metali bağlı, antijene bağlanıyorsa elektron geçirmiyor IEM Katı faz, kesit alınmış doku parçası

57 Katı faz tekniklerinde sonuç bir görüntüleme ile elde edilir
Görüntü Sağlayan İşaretleyiciler: Enzimle renk gelişimi → ELISA Boya çökmesi → İmmün histokimya (IHA) Floresans veren boya → Floresans mikroskopi (IFA) ve akan hücre ölçer Metal atomu bağlama → IEM Radyoaktif ışıma veren atom → RIA

58 ELISA Dolaylı ELISA Doğrudan ELISA

59 RIA

60 Doku üzerinde IHA

61 IFA

62 Lenfositler içindeki CD4+ nüfusun ‘’floresan işaretli anti-CD4 antikoru’’ ve Akan Hücre Ölçer kullanılarak saptanması-1

63 Lenfositler içindeki CD4+ nüfusun ‘’floresan işaretli anti-CD4 antikoru’’ ve Akan Hücre Ölçer kullanılarak saptanması-2 Yan yansıtıcı= granülerite Ön yansıtıcı= büyüklük

64 Lenfositler içindeki CD4+ nüfusun ‘’floresan işaretli anti-CD4 antikoru’’ ve Akan Hücre Ölçer kullanılarak saptanması-3 CD4+ hücreler yeşil ışık alan PMT1’de ölçüldü CD4- hücreler kırmızı ışık alan PMT2’de ölçüldü Yan yansıtıcı= granülerite SONUÇ: = 100 kat fazla Ön yansıtıcı= büyüklük