MİKROBİYOLOJİ UYGULAMA BESİYERİ-MİKROBİYOLOJİK ÖRNEK ALMA VE KÜLTİVASYON Araş.Gör. Elif Ayşe ANLI
BESİYERİ Mikroorganizmalar; Üreme, canlılıklarını devam ettirme, saf kültürlerin elde edilmesi, biyokimyasal özelliklerinin incelenmesi, biyolojik ve metabolik ürünlerinin elde edilmesi amaçlarıyla çoğaltılırlar. Mikroorganizmaları bulundukları ortam dışında çoğaltmak için kullanılan, genel olarak mikroorganizmaların ihtiyaç duydukları besleyici ortamlara besiyeri adı verilmektedir.
BESİYERİ BİLEŞİMİNDE YER ALAN MADDELER Su Karbon ve enerji kaynağı maddeler (karbonhidratlar, yokluğu ve yetersizliğinde proteinler vb.) Azot kaynağı maddeler (proteinler, peptonlar, amino asitler vb.) İnorganik maddeler (makro ve mikro elementler) Üreme faktörleri (vitaminler, aminoasitler, pürin ve pirimidinler vb.)
MİKROORGANİZMALARIN BESİN GEREKSİNİMLERİ Bütün mikroorganizmalar için geçerli olan besiyeri formülü vermek mümkün değildir. Örneğin; ototrof bakteriler (basit inorganik maddeler), heterotrof bakteriler üreme faktörleri dışındaki bütün maddelere gereksinim duyarlar. Bazı patojen ve laktik asit bakterileri üretiminde kullanılacak olan besiyerlerinde diğer maddelerin yanı sıra bazı üreme faktörlerinin ilavesi zorunludur.
MİKROORGANİZMALARIN BESİN GEREKSİNİMLERİ Ancak Nutrient Broth ve Nutrient Agar pek çok bakterinin gelişimine olanak sağlayan besiyerleridir. Ancak bunlar bazı besiyerleri için temel besiyeri olarak da kabul edilebilmektedir. Bileşimine kan, serum, yeast ekstraktı ve süt gibi besleyici öğeler eklenerek daha kompleks yapıda farklı besiyerleri elde edilebilmektedir.
BESİYERLERİNİN SINIFLANDIRILMASI 1. GENEL OLARAK Canlı besiyerleri Doğal besiyerleri Sentetik besiyerleri 2. FİZİKSEL ÖZELLİKLERİNE GÖRE Katı besiyerleri Sıvı besiyerleri 3. KAYNAKLARINA GÖRE Hayvansal kaynaklı besiyerleri Bitkisel kaynaklı besiyerleri 4. KULLANIM AMACINA GÖRE Genel besiyerleri Özel besiyerleri
1. GENEL SINIFLANDIRMAYA GÖRE BESİYERLERİ Canlı besiyerleri Virüs ve riketsiyaları üretmek için kullanılır. Doğal besiyerleri Bileşimlerinde büyük çoğunlukla üzüm şırası ve malt suyu gibi doğal ürünler bulunmaktadır.bu nedenle bileşimine giren maddeler tam olarak kontrol edilememektedir. Sentetik besiyerleri Mikrobiyoloji laboratuvarlarında kullanılan besiyerlerinin çoğunluğu sentetiktir. Kuru formda (dehidrate) ve hazır karışım halinde firmalar tarafından üretilerek pazarlanmaktadır.
2. FİZİKSEL ÖZELLİKLERİNE GÖRE BESİYERLERİ Katı besiyerleri İçerisinde katılaştırıcı ajan bulunmaktadır. Katılaştırıcı ajan(madde) genel olarak agardır. Jelatin, pıhtılaştırılmış serum, yumurta ile mikroorganizmalar için inert maddeler olan silika jel, karregenanlar, aljinatlar ve poliakrilamidler katılaştırıcı ajan olarak kullanılabilmektedir. Sıvı besiyerleri İçerisinde katılaştırıcı ajan bulunmayan ve daha çok üremeyi teşvik edici besiyerleridir. (Pepton Water, Nutrient Broth)
3. KAYNAKLARINA GÖRE BESİYERLERİ Hayvansal kaynaklı besiyerleri Et suyu, balık unu, yumurta sarısı, karaciğer gibi hayvansal kaynaklar içeren besiyerleridir. Bitkisel kaynaklı besiyerleri Portakal serumu besiyeri gibi.
4. KULLANIM AMACINA GÖRE BESİYERLERİ Genel besiyerleri Birçok mikrorganizmanın üremesine olanak sağlayan besiyerleridir. (Nutrient Broth, Nutrient Agar) Laktik asit bakterileri ve üretimi zor olan patojen bakteriler dışında pek çok bakteri üreyebilmektedir. Özel besiyerleri Belirli bir amaç veya belirli bir mikroorganizma için kullanılan besiyerleridir. Canlandırma besiyeri Selektif (seçici) besiyeri Elektif (seçime dönük) besiyerleri Differansiyel farklara dönük) besiyerleri Zenginleştirme besiyerleri Biyokimyasal test besiyerleri Tamamlama ya da doğrulama besiyerleri İndirgenmiş besiyerleri
ÖZEL BESİYERLERİ- 1. CANLANDIRMA BESİYERLERİ Canlılık oranı düşük veya belirli bir ortamda hasar görmüş mikroorganizmaların canlandırıldığı, adaptasyonunun sağlandığı veya kolaylaştırıldığı sıvı besiyerleridir.
ÖZEL BESİYERLERİ- 2. SELEKTİF (SEÇİCİ) BESİYERLERİ Besiyeri içerisinde bulunan inhibitor ajanlar belirli mikroorganizmaların metabolizma ve enzim sistemlerini olumsuz yönde etkiler ve bu şekilde besiyeri; incelenen örnekteki yalnızca belli bir mikroorganizma veya mikroorganizma grubunun tipik olarak gelişimine olanak sağlar. Katı veya sıvı olabilmektedir. Besiyeri katı ise besiyerine özgü mikroorganizma veya mikroorganizma grubu tipik koloniler oluşturur ve/veya besiyerinde renk değişimi gibi değişimlere neden olurlar. Sıvı besiyerinde ise renk değişimi veya gaz oluşumu gibi değişimler meydana getirirler.
ÖZEL BESİYERLERİ- SELEKTİF (SEÇİCİ) BESİYERLERİ EMB Agar: Koliform grubu bakterilerin teşhis ve ayırımı SS Agar: Salmonella ve Shigella cinsi bakterilerin izolasyonu ve teşhisi Baird-Parker Agar: Staphylococcus aureus izolasyonu ve sayımı Violet Red Bile Agar (VRBA) Koliform grubu bakterilerin teşhisi, izolasyonu ve sayımı için uygundur. Brilliant Green Bile Broth (BGBB): Koliform bakterilerin teşhisi ve varlığının doğrulanması MacConkey Broth (Purple): Koliform bakterilerin teşhisi Glucose Azide Broth: Fekal streptokokların belirlenmesi Talyum asetat içeren herhangi bir glukoz agar: Laktik streptokokların izolasyonu
SELEKTİF (SEÇİCİ) BESİYERLERİNİN BİLEŞİMİ BELİRLENİRKEN İZLENECEK YOLLAR Mikroorganizmaların gelişebilmesi için temel maddelere yer verilir. İstenmeyen mikroorganizmaların gelişimini engelleyecek inhibitör ajanlar (çeşitli boyalar, antibiyotikleri,safra tuzları, potasyum tellurit, selenit, tetratiyonat, sodyum azid, talyum asetat vb) ilave edilerek besiyerine seçicilik kazandırılır. Diğer taraftan besiyerinin pH gibi özellikleri ile inkübasyon koşulları (inkübasyon sıcaklığı) değiştirilerek de seçicilik sağlanbilmektedir. Örnek: maya ve küf üretiminde PDA (Potato Dextrose Agar) gibi besiyerlerine sterilizasyon sonrasında % 10’luk steril laktik asit veya tartarik asitten belirli miktarda eklenerek besiyeri pH’sı 3,5 civarına düşürülür böylece asidofilik bakteriler dışındaki diğer bakterilerin gelişmesi engellenir.
SELEKTİF (SEÇİCİ) BESİYERLERİNİN BİLEŞİMİ BELİRLENİRKEN İZLENECEK YOLLAR Besiyerine özgü mikroorganizmaların gelişimlerini gözlemek üzere besiyeri bileşimine bazı indikatörler ( fenol red, brom timol mavisi, brom kresol moru, litmus vb) ilave edilir. Her indikatör belirli pH’larda kendine özgü renk değişikliği gösterir. Brilliant Green Bile Broth (BGBB) gibi bazı sıvı besiyerleri Durham tüpü yerleştirilerek hazırlanır. Bu besiyerine özgü mikroorganizmalar (koliform grubu bakteriler) besiyerinde laktozu fermente ederek gaz oluşumuna neden olurlar. Durham tüpü sayesinde gaz oluşumu tespit edilir.
ÖZEL BESİYERLERİ- 3. ELEKTİF (SEÇİME DÖNÜK) BESİYERLERİ Belirli bir mikroorganizmanın minimum beslenme gereksinimlerini karşılayacak şekilde formüle edilen besiyerleridir.
ÖZEL BESİYERLERİ- 4. DİFERANSİYEL (FARKLARA DÖNÜK) BESİYERLERİ Belirli mikroorganizma türlerinin karakteristik koloniler oluşturarak kolayca tanımlanabilir hale geldiği agarlı besiyerleridir. Örneğin Kanlı Agar besiyeri, hemolitik ve non-hemolitik bakteri türlerinin ayırt edilebildiği diferansiyel bir besiyeridir. (Selektif besiyeri kavramı içerisinde incelenmez) Ancak MacConkey Agar hem selektif hem de diferansiyel besiyeri özelliği gösterir. Bu besiyerinde laktozu fermente eden koliform bakteriler kırmızı renkli koloniler oluştururken laktozu fermente edemeyen diğer bağırsak bakterileri (Örneğin Salmonella türleri) renksiz koloniler oluşturur. Kırmızı renk laktozun fermentasyonu sonucunda oluşan asitlerin besiyerindeki nötral red indikatörünü etkilemesinden kaynaklanmaktadır.
NOT: Selektif, elektif ve diferansiyel besiyerlerinden bir örnekte veya karışık kültürdeki mikroorganizma veya mikroorganizma grubunu ayırmak (izole etmek) için yaralanılmaktadır. Daha sonraki aşamalarda ayrılan mikroorganizmanın saf kültürleri yapılmaktadır.
ÖZEL BESİYERLERİ- 5. ZENGİNLEŞTİRME BESİYERLERİ İzole edilmek istenen mikroorganizmanın bolca üretilebilmesi amacıyla bu mikroorganizmanın birkaç fizyolojik isteğinin (pH, besin maddesi vb) optimum düzeyde karşılayacak şekilde formüle edilen özel sıvı besiyerleridir. GC-Broth: stafilokoklar, EE-Broth: Enterik bakteriler, Selenite Broth ve Tetrathionate Broth Salmonella izolasyonu amacıyla kullanılan zenginleştirme besiyerleridir.
ÖZEL BESİYERLERİ- 6. BİYOKİMYASAL TEST BESİYERLERİ Bileşimine çeşitli indikatörler ve test edilecek kimyasal maddeler (karbonhidratlar, arjinin, üre, nitrat, sitrat vb.) eklenerek hazırlanan sıvı veya katı besiyerleridir. Besiyerinde mikroorganizmaların test edilen maddeyi biyokimyasal değişime uğratıp uğratmadığı test edilir. Karbonhidrat fermentasyon test besiyerleri, Üre broth besiyeri vb örneklerdir.
ÖZEL BESİYERLERİ- 7. TAMAMLAMA YA DA DOĞRULAMA BESİYERLERİ Mikroorganizmaların metabolizma ürünleri saptanarak teşhise gidilen besiyerleridir. Metabolizma ürünlerinin meydana gelişi inkübasyondan sonra kültüre ilave edilen indikatör maddeler veya ayıraçlar (Kovac’s ayıracı gibi) ile saptanır. Trypone Water, Glukoz fosfat broth örnekleridir.
ÖZEL BESİYERLERİ- 7. İNDİRGENMİŞ BESİYERLERİ Bileşiminde anaerobik mikroorganizmaların daha iyi gelişimini sağlamak amacıyla tiyoglikonat gibi indirgen maddeler eklenmiş besiyerleridir. İndirgen maddeler besiyerindeki çözünmüş oksijen ile kimyasal olarak etkileşime girerek anaerob mikroorganizmalar için uygun bir ortam yaratır.
BESİYERİ BİLEŞİMİNE GİREN TEMEL MADDELER Agar Pepton Yeast extract (Maya Ekstraktı) Beef extract (Et Ekstraktı) Tuz (NaCl) Jelatin Karbonhidratlar Kan Tampon maddeler (Buffer) İnorganik Maddeler
BESİYERİ BİLEŞİMİNE GİREN TEMEL MADDELER Agar: Besiyerlerinde katılaştırıcı ajandır. Bazı deniz yosunlarından elde edilir. Pepton: proteinlerin hidrolizi ile elde edilen ürünlere verilen genel bir isimdir. Proteinleri (enzim sistemleri olmadığı için) çok az sayıda mikrorganizma azot kaynağı olarak kullanabilmektedir. Yeast extract: Ekmek mayasından (Saccharomyces cerevisiae)enzim veya asit hidrolizi ya da otolizasyonu yolu elde edilir. Suda çözünebilen azotlu maddeler, vitaminler özellikle de B kompleks vitaminleri yönünden zengin bir kaynaktır. Beef extract: Genellikle yağsız sığır etinden ellde edilir. Protein içermez ancak suda çözünen azotlu maddeler ile suda çözünen mineral maddeler, iz elementler, üreme faktörleri ve çok az miktarda karbonhidrat içerirler. Besiyerlerine genellikle % 1 oranında eklenir. Tuz: izotonik ortam yaratmak amacıyla kullanılır.
BESİYERİ BİLEŞİMİNE GİREN TEMEL MADDELER Jelatin: Süt emmekte olan hayvanların kemiklerinden elde edilir. Protein yapıdadır. Katılaşıtırıcı ajan olmaktan çok mikroorganizmaların proteolitik enzim aktivitesini ortaya koymak amacıyla kullanılır. Karbonhidratlar: Besiyerlerine genellikle % 0.1- 1.0 oranında katılırlar. Bazı karbonhidratlar belirli bazı tuzlarla birlikte otoklavda sterilize edilirse besiyerinde mikroorganizmaların üremesini inhibe eden bileşikler meydana getirebilmektedir. Kan: belirli bazı besiyerlerine zenginleştirme veya bakterilerin hemoliz yapma durumunu ortaya koyma amaçlarıyla eklenir. Tampon maddeler (Buffer): çözelti içerisindeki ani ve hızlı pH değişimlerini kontrol etmek için eklenen zayıf asit veya bazların tuzlarıdır. İnorganik maddeler: Besiyerlerinin pek çoğunda bu bileşenlere ayrıca yer verilmemektedir. Çünkü pepton, yeast extract, beef extract, tampon maddeler ile agar gibi maddelerde yeterli düzeyde inorganik madde bulunmaktadır.
BESİYERLERİNİN SAHİP OLMASI GEREKEN ÖZELİKLER BESİYERİ HAZIRLIK AŞAMALARI STERİLİZASYON (Genellikle besiyerleri otoklavda 115 -134 °C’ler arasında belli süre sterilize edilmektedir). Genel bir kural olarak sterilizasyonda yüksek sıcaklık- kısa süre uygulamasının daha uygun olduğu kabul edilmektedir.
MİKROBİYOLOJİK ÖRNEK ALMA VE KÜLTÜR YAPMA(KÜLTİVASYON) Kültür tanımı: üzerinde veya içinde mikroorganizma üretilmiş besiyerlerine kültür adı verilir. Kültür tipleri: Saf kültür Karışık kültür Sıvı kültür Katı kültür
KÜLTÜR TİPLERİ Saf kültür: Besiyerinde yalnızca tek bir mikroorganizma türü üretilmiş kültürlerdir. Karışık kültür: İki veya daha fazla çeşitte mikroorganizma türü aynı besiyerinde üretilmişse buna karışık kültür denir. Sıvı kültür: Sıvı besiyerinde oluşturulmuş kültürlerdir. Katı kültür: Katı besiyerinde (agar içeren) geliştirilmiş kültürlerdir. Agarlı besiyerinin bileşimi, hazırlanışı ve örneğin inokülasyon şekline göre değişik isimlerle anılabilmektedir.
KÜLTÜR TİPLERİ-KATI KÜLTÜR Yatık agarlı kültür Saplama kültür Yarı katı kültür Çalkalama kültür Plak kültürler (kültür kabı olarak Petri kutusu) kullanılan kültürlerdir.
KÜLTÜR YAPMA (KÜLTİVASYON) Mikroorganizmaların bulundukları ortamdan belirli tekniklerle alınarak uygun besleyici ortama (besiyerine) aktarılması ve burada gelişmelerinin sağlanması aşamalarını içerir. Kültüre ait bilgiler hazırlık aşamasında örnek besiyerine aktarılmadan besiyerinin hazırlandığı petri kutusu, tüp, balon veya erlenmayer üzerine yazılmalıdır.
KÜLTÜRE AİT BİLGİLER İnkübasyonun başlatıldığı tarih ve gerekli ise saat Ekimi yapılan örneğin adı veya kodu Örneğin dilüsyon oranı (dilüsyon yapılmışsa) Gerekirse besiyerinin adı Gerekirse inkübasyon sıcaklığı ve süresi
KÜLTÜR ELDE ETME AŞAMALARI Örnek alma ve alınan örneğin inokülasyona hazırlanması (aseptik koşullarda) Dilüsyon hazırlama ve İnokülasyon (Ekim, Aşılama) İnkübasyon KÜLTÜR
AKTARMA TEKNİKLERİ VE KULLANILAN ALETLER İnokülasyon incelenecek veya geliştirilecek olan kültür mikroorganizmasının uygun besiyerine transferidir. İnokulasyon işleminde öze, iğne öze, pipet, eküvyon (yüzeylerden örnek alınırken) kullanılan aletlerdir. İnkübasyon: Kültür elde etmedeki en son aşamadır. Ekim yapılmış besiyeri içeren kabın uygun bir inkübatörde belirli sıcaklık derecesinde ve belirli süre tutulması işlemidir. İnkübasyon için genellikle etüv ya da su banyosu gibi inkübatörlerden faydalanılır.
AKTARMA TEKNİKLERİ Tüpteki sıvı besiyerine inokülasyon Petri kutusundaki agarlı besiyerine inokülasyon Sıvı örnekten direkt aktarma (aktarılacak hacmin önemli olmadığı durumlarda sıvı örnekten direkt olarak aktarma yapılır). Yüzeylerden örnek alma ve inokülasyon Steril eküvyon örnek alınacak bölgeye götürülerek eküvyon çubuğu aseptik koşullarda tüpünden çıkarılarak ucundaki pamuk kısmı yüzeye kuvvetlice sürülür. Daha sonra eküvyon çubuğu hiçbir yere temas ettirilmeden tüpüne yerleştirilir. Tüp en kısa sürede ekim için laboratuvara getirilir. Bunzen beki yanında alev çatısı altında eküvyon çubuğunun ucu daha önceden hazırlanmış olan petri kutusundaki agarlı besiyeri üzerine besiyerine zarar vermeden temas ettirilir. Daha sonra petri kutusunun kapağı kapatılır ve eküvyon çubuğu tüpüne yerleştirilir. Sterilize edilmek üzere ayrılır. Daha sonra petri kutusundaki besiyerinde örneğin temas ettirildiği noktadan başlayarak öze ile sürme işlemi gerçekleştirilir. Dik agarlı besiyerine saplama ekim
PETRİ KUTUSUNDAKİ AGARLI BESİYERİNE İNOKULASYON Sürme, dökme, yayma tekniklerinden birisi kullanılarak inokülasyon yapılabilir. Sürme yönteminde öze kullanılır. Tek koloni düşürme tekniği olarak da ifade edilmektedir. Sürme tekniğinde öze ucuyla örnek alındıktan sonra örnek agar yüzeyinin seçilen bir bölgesinden temas ettirilir. Zigzag çizilerek sürme olayı ilerledikçe örnekteki mikroorganizma sayısı ilk sürüldüğü noktaya göre azalmaktadır. Bunun sonucunda inkübasyonu takiben son sürme işleminin yapıldığı agar yüzeyinde izole koloniler elde edilmektedir.
PETRİ KUTUSUNDAKİ AGARLI BESİYERİNE İNOKULASYON Yayma tekniği: petri kutusundaki besiyeri yüzeyine pastör pipeti ya da 0.1 mL örnek aktarılır. Örnek Drigalski özesi kullanılarak kurutulmuş agar yüzeyine uygun şekilde yayılır. Dökme plak yöntemi: Sıvı kültürlerden veya sıvı örnekten (seri dilüsyonlar yapılmış) steril pipetle 1mL alınarak steril boş petri kutusuna aktarılır. Üzerine daha önceden sterilize edilmiş ve 44-48°C’ye ayarlanmış su banyosunda tutulan katı besiyerinden petri kutusuna 15-20 mL dökülür. Besiyeri içerisinde örneğin homojen dağılması sağlanır.
SAF KÜLTÜR ELDESİ 2 aşamada gerçekleştirilir. İzole kolonilerin elde edilmesi (Petri kutusunda uygun besiyerinde) İzole koloninin ayrılması ayrı bir besiyerine aktarılması (Genellikle önce sıvı sonra katı besiyerine aktarılması)
KÜLTÜRLERİN MUHAFAZASI Kültürler genellikle buzdolabında 0-5°C’de muhafaza edilmektedir. Ayrıca dondurarak derin dondurucuda -20 °C’de , sıvı azot içerisinde -196 °C’de, donmuş halde veya liyofilize stok kültürlerini hazırlayarak kuru formda canlılık ve aktivitelerini yitirmeden uzun süre saklamak mümkündür.
STOK KÜLTÜR Saf kültür olarak elde edilen kültürler daha sonra kullanılmak üzere stok kültürleri yapılarak saklanır. Stok kültür 2 şekilde yapılabilir. Yatık kültür: Yatık agarlı uygun besiyeri kullanılır. Stok kültür eldesinde inkübasyon süresi kısa tutulur. Agar yüzeyinde kolonilerin görünmesi süre için yeterlidir. Stok kültürler genellikle 0-5°C’de buzdolabında ya da karanlık serin bir yerde 1-6 ay bekletilebilir.(mikroorganizmanın özelliğine göre süre (daha az olabilmekte) değişebilmektedir. Liyofilize (freeze-dried) kültürler: Bu yöntemle mikroorganizmalar bir cam ampul ya da uygun materyalden yapılmış bir poşet içerisinde liyofilize edilerek kuru formda saklanabilir. Kültürün aktivasyonu için aseptik koşullarda uygun bir sıvı besiyerine kültürün aktarılarak inkübasyonu sağlanır.
BAŞARILAR DİLERİM Araş. Gör Elif Ayşe ANLI