Hazırlayan: Arş.Gör. Nahit GENÇER Danışman: Prof.Dr. Oktay ARSLAN Zeytin Çeşitlerindeki Antioksidan Kapasite ve PPO Enzimi İle İlişkisinin Araştırılması Hazırlayan: Arş.Gör. Nahit GENÇER Danışman: Prof.Dr. Oktay ARSLAN

Çalışmamızda Aşağıdaki Hedefler Belirlenmiştir; Zeytin yağlarındaki -tokoferol, ferulik asit, kafeik asit ve tirozolün konsantrasyonlarının HPLC ile saptanması Zeytinlerdeki PPO’nun katalitik aktivitesinin (KM ve Vmax) belirlenmesi Enzim aktivitesi üzerine pH ve sıcaklık etkisinin araştırılması Türler arasındaki PPO aktivitesi ile antioksidanların miktarı arasındaki korelasyonun incelenmesi

Neden Farklı Zeytin Çeşitleri? Çünkü; türden türe antioksidan madde miktarı ve polifenol oksidaz enziminin aktivitesi değiştiği düşünülmektedir.

PPO ile Antioksidanlar Arasında Nasıl Bir İlişki Var?

Zeytin Ve Zeytin Yağı Zeytin gıda olarak, zeytin yağının eldesin de ve yenilebilir meyveleri için yetiştirilmektedir. Zeytinyağı esansiyel yağ asitlerinin kaynağı ve yağda çözünen A,D,E,K vitaminlerinin deposudur. Zeytin yağı tüketen insanlarda kanser oranının az olduğu hakkında bir çok araştırma vardır.

Zeytin Yağındaki Fenol Bileşikleri Zeytin yağında 50 ile 1000 mg/kg arasında basit ve kompleks fenol bileşikleri vardır. Zeytin yağı; tokoferoller, karotenoidler ve fenolik bileşikler gibi doğal antioksidanları içerir. Fenolik bileşikler arasında ferulik asit, kafeik asit, gallik asit, kumarik asit, tirozol ve hidroksitirozol en çok yer alır.

Antioksidanlar Reaktif oksijen türlerinin oluşumunu ve bunların meydana getirdiği hasarı önlemek için vücuttaki savunma sistemlerine Antioksidanlar denir.

Antioksidan Nedir? Canlı dokularda istenmeyen oksidasyon reaksiyonlarını önleyen maddeler ANTİOKSİDANLAR’dır . Vitaminler ve mineraller yanında bazı enzimler de antioksindandırlar. Antioksidanlar, oksidatif stresle oluşan serbest radikaller olarak adlandırılan zararlı moleküllere karşı koruyucu etkiye sahiptirler.

Serbest Radikaller Nelerdir? Üzerinde elektron fazlalığı veya eksikliği nedeniyle yüklü olan kimyasal olarak aktif atom veya moleküllerdir.

Serbest Radikaller özellikle reaktif tür oksijen içerirler. Bunlar; hidrojen peroksit, alkoksit ve ozon gibi eşleşmemiş elektronu bulunmayan oksijen türevleri ile hidroksil, peroksil, alkoksil, azot oksit, azot trioksit ve süperoksit radikallerini içerir.

Serbest Radikaller Nasıl Oluşur? Serbest radikaller hem vücudun içinde hem de dışındaki etkenler tarafından meydana gelir. Oksijenli solunum, metabolizma ve enfeksiyon gibi vücut içinden kaynaklanan olayların yanında; sigara, alkol, x-ışınları, güneş ışını ve kirlilik gibi dış kaynaklı çevresel faktörlerin etkisiyle de serbest radikaller oluşur.

*Sigara ve alkol yanında strese bağlı olarak ta vücutta bu moleküllerin üretimi gerçekleşmektedir.

Serbest Radikallerin Zararları Nelerdir? Serbest radikaller vücudun her yerinde elektron verip yada alabilirler. Böylelikle hücreler, proteinler ve DNA’ya zarar verebilirler.

Antioksidanların Fonksiyonu Antioksidanlar; serbest radikalleri etkisiz hale getirerek oksidasyon prosesini engellerler. Bu esnada kendileri okside olurlar. Bu nedenle antioksidan kaynaklı gıdalara sürekli ihtiyacımız vardır.

Zeytin Yağındaki Antioksidanlar 1-Tokoferoller: Tokoferol türevlerinin genel bir adı vitamin E’dir ve bu bileşikler E vitamininin aktivitesine sahiptir. Bu yüzden, gösterdikleri aktiviteler bazı hastalıklarda antioksidan etkilerinin olduğunu ispatlamak için oldukça önemlidir.

E vitamini hücre membranlarında bulunan en büyük zincir kıran antioksidandır. Kalp hastalıkları, kanser, katarakt ve sinir hastalıkları gibi rahatsızlıkların gelişmesini önlemede çok etkilidir.

Vitamin E’nin farklı formları hücre membranında farklı derecelerde antioksidan etki gösterir.  -tokoferol en çok bulunan, vücutta en yüksek canlı potansiyeline ve en kuvvetli etkiye sahip izomerdir. Bu izomer, yağda çözülebildiği için hücre membranının yapısının çoğunu oluşturan yağ asitlerinin serbest radikaller ile zarar görmesini önleyen tek formudur.

Tokoferoller; hücre membranı içindeki doymamış yağ asitlerini ve LDL’nin okside olmasını önlerken kalp hastalıklarının azalmasında, alzaimer hastalığını geciktirmede ve kanserin önlenmesinde çok fazla etkiye sahiptir .  

Tokoferollerin antioksidan mekanizması; 6-hidroksil. -tokoferol

2-Ferulik Asit: Antioksidan etkiyi sağlamak için fenolik OH grupları ile serbest radikallere hidrojenler verir. Radikal ve aktif oksijen türlerini yok etme etkisine sahip olan ferulik asit, aktif oksijen üretimine sebep olan UV ışığı absorplar.

3-Kafeik asit: Zeytin yağının oksidasyonun da kendini ilk feda edenler arasındadır. Yapısı ferulik aside çok benzer.

4-Tirozol: Zihinsel ve fiziksel yorgunluklarda, hafıza kayıplarında yardımcı etkiye sahiptir. Diğer fenolik bileşikler gibi yapısındaki hidroksil grubundan bir hidrojeni serbest radikellere vererek onları etkisiz hale getirir. Bunun sonucunda da kendisi okside olur.

Enzimatik Kararma Meyve ve sebzelerin depolanması esnasında ve çarpma, kesme, kabuk soyma, dilimleme gibi mekanik zedelenmeler sonucu bazı renk değişimleri ortaya çıkmaktadır. Pembeden, mavimsi siyaha kadar olan farklı tonlardaki bu renk değişimlerine kararma denir. Enzimatik kararmanın olabilmesi için polifenol oksidaz enzimi, bunun etkilediği fenolik madde ve moleküler oksijenin bir arada bulunmaları gerekir.

PPO NEDİR ? PPO enzimi birçok meyve ve sebzede bulunan ve bitkinin hastalıklara karşı direncini arttıran bir metalo enzimdir. Gıda endüstrisindeki önemi ise , enzimatik kararmaya neden olmasından kaynaklanmaktadır.

GIDA ÜRÜNLERİ NEDEN KARARIR? Enzimatik Kararma: Polifenol oksidaz enzimi Enzimatik Olmayan Kararma: Mailard reaksiyonu

Enzimatik Kararma Reaksiyonu

Kararmanın Önemi İnsan ve çevre sağlığı. Damak zevki. Antioksidan kapasitenin düşmesi

Koku Renk Tat Antioksidan Kapasite

Kararmanın Önlenmesi pH İyonik şiddet Sıcaklık İnhibitör

Yapılan Laboratuar Çalışmaları-1 1.Optimum pH 2. KM, Vmax çalışması 3.Denatürasyon-Renatürasyon çalışması

Optimum pH nedir? Bir enzimin optimum pH’ sı maksimum aktivite gösterdiği pH dır. Optimum pH (7)

Optimum pH çalışma sonuçları

KM nedir? KM: Maksimum hızın yarısına ulaşmak için gereken substrat konsantrasyonuna KM denir. Enzimin substrata karşı ilgisinin bir ölçüsüdür.

Vmax nedir? Vmax: Enzimin katalitik aktivitesinin bir ifadesidir. Toplam enzimin tümünün aktif bölgesinin substratla dolduğu andaki reaksiyon hızıdır.

Micheales-Menten denklemi Lineweaver-Burk denklemi

Lineweaver-Burk Grafiği

KM ve Vmax çalışması Enzim Kaynağı Optimum pH Km (mM) Vmax (U/mLdak)   Enzim Kaynağı Optimum pH Km (mM) Vmax (U/mLdak) Vmax / Km GZPPO 6.5 22.491 3681.890 163.71x103 EZPPO 13.691 810.180 59.18x103 UZPPO 5.747 7183.392 1249.94x103 DZPPO 7.0 6.098 5325.381 873,30x103 KZPPO 5,251 538.474 102,55x103

Denatürasyon ve Renatürasyon Denatürasyon: Protein yapısında olan enzimlerin yüksek sıcaklık, pH ve iyonik şiddet karşısında üç boyutlu yapılarının kaybolması olayıdır. Renatürasyon: Denatüre edici faktörler ortadan kaldırıldığında enzimin eski halini alması olayıdır.

Laboratuvar Çalışmaları-2 Her bir zeytin çeşidinden ayrı ayrı yağ çıkarıldı. Yağlardan tokoferolün ekstraksiyonu için metanol/izopropanol karışımı kullanıldı. Ferulik asit, kafeik asit ve tirozolün ekstraksiyonu için metanol/su karışımı kullanıldı.

Herbir antioksidan için değişik konsantrasyonlar hazırlanarak HPLC’ye yükleme yapıldı. Gelme zamanına karşı absorbans grafikleri çizildi.

Daha sonra her bir antioksidan için kalibrasyon eğrileri oluşturuldu.

Her bir zeytin yağı ekstraktı HPLC analizine sunuldu ve antioksidanların miktar tayinleri yapıldı.

Herbir zeytin türündeki antioksidanların miktarları Tirosol (mg/kg) Kafeik asit (mg/kg) Ferulik asit (mg/kg) Tokoferol (mg/kg) Domat 1.34 1.69 3.43 6.35 Edremit - 1.56 11.3 Gemlik 22.0 Kiraz 1.1 3.54 26.5 Uslu 9.84 1.51 3.68 33.7

SONUÇLAR pH=5-8 de enzim önemli ölçüde aktivite göstermektedir. Termal denatürasyon 70-80 derecelerde yapılmalı. Farklı zeytin türlerinde PPO farklı katalitik aktivitelere sahip. Uslu zeytininde antioksidan miktarı ve PPO aktivitesi en yüksek

Teşekkürler