AFLP (Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizimi) (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) AFLP (Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizimi)

Moleküler Sistematikte Kullanılan Bazı Teknikler PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) RFLP (Restriction fragment length polymorphism) AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) DNA Dizi Analizi

aflp

Bu yöntem PCR dayanarak 1995 yılında Vos ve arkadaşları tarafından bulunmuştur, RFLP ve PCR kullanımı tekniklerini içerir, AFLP kullanılan RFLP den daha hızlı, daha az emek ister ve daha fazla bilgi sağlar, Tekrarlanabilirliği fazladır.

Çoğaltılmış parça uzunluğu polimorfizmi, 1990'lar başında uygulamaya sokulmuştur. Bu teknik RFLP'den daha hızlı çalışır ve DNA örneklerini çoğaltmak için PCR kullanılır. Değişken sayılı bitişik tekrar polimorfizmlerine dayalı aleller ayırdedilir, bunlar poliakrilamit jel elektroforezi ile ayrıştırılır.

Bantlar gümüş boyaması ile görülür Bantlar gümüş boyaması ile görülür. Analiz jelde yapıldığı için, çok yüksek sayılı tekrarlar jelin tepesinde sıkışabilirler ve birbirlerinden ayırt edilmeleri zor olabilir. AmpFLP analizi yüksek oranda otomatikleştirilebilir. Bu yöntemle kişisel DNA örnekleri karşılaştırılarak filogenetik ağaçlar yaratılabilir.

Düşük maliyeti, hazırlanma ve çalıştırma kolaylığı gibi nedenlerden dolayı AmpFLP hâlâ az gelirli ülkelerde yaygın olarak kullanılır. Genomik DNA’nın restriksiyon enzimi ile kesimi sonucu oluşan DNA parçalarının bir grubunun selektif amplifikasyonu (seçici yükseltme) esasına dayanan bir genotipleme metodudur.

RFLP ve PCR tekniklerini içeriğinde barındırır. AFLP daha fazla bilgi sağlar. Moleküler markörler, genomda herhangi bir gen bölgesi yada gen bölgesi ile ilişkili DNA parçasıdır. Bu markörler, polimeraz zincir reaksiyonuna bağlı olmayanlar(RFLP) ve bağlı olanlar (RAPD,AFLP,SSR) olarak adlandırılmaktadır. AFLP tekniği, RFLP tekniğinin kesme-tanıma kısımlarının PCR ile çoğaltılmasına dayalı bir DNA markır tekniğidir.

Çoğaltılan parça uzunluğu farklılığı veya polimorfizmi anlamına gelen AFLP tekniği, RAPD tekniğini ile RFLP tekniğinin birleştirilmiş formu olup RAPD tekniğinin dezavantajlarını gidermek üzere geliştirilmiştir. AFLP, toplam DNA’nın kesildikten sonra PCR reaksiyonuyla çoğaltılması esasına dayanan güçlü bir tekniktir. Bu teknikte genomik DNA genellikle önce birisi altı, diğeri dört bazı tanıyan iki kesim enzimi (RE) tarafından kesilir. Kesilen parçaların uçlarına nükleotid dizilişi sentetik olan DNA`lar eklenir. (Adaptör)

Eklenen sentetik DNA`nın yani adaptörün nükleotid dizilişini de taşıyan başlatıcı DNA`lar yani primerlerin kullanımıyla nispeten spesifik DNA çoğaltımı yapılır. Bu çoğaltma iki aşamada gerçekleştirilir. İlk aşamada her iki uçtan DNA kesim enzimlerinin tanıdığı diziden sonraki ilk nükleotide göre seçici çoğaltımın yapıldığı ön üretim yapılır. Asıl üretimde ön üretimde elde edilen parçaların kullanımıyla kesim enzimi tanıma yerinden sonraki ikinci ve üçüncü nükleotidler için seçici üretim yapılır.

Bütün başlatıcılar sentetik uçların nükleotid dizilişini de taşıdığı için üretim oldukça spesifik şartlarda yapılmış olur. Üretilen parçacıklar bir baz uzunluğu farklarını dahi ayırt edebilen poliakrilamid jel üzerinde hareket ettirilerek farklı genotiplere ait farklılık gösteren parçacıklar tespit edilir.

AFLP Analizi’ NİN BASAMAKLARI: 1. DNA ekstraksiyonu işlemi yapılır.

2. DNA uygun restriksiyon enzimleri ile kesilir 2. DNA uygun restriksiyon enzimleri ile kesilir. Küt uç ve yapışkan uç oluşturan enzimler kullanılır.

3. Adaptör moleküllerin restriksiyon enzimleri ile kesilmiş DNA moleküllerine bağlanır. Adaptörler, enzimin tanıdığı baz dizilerini, bir de 20 nükleotid kadar bildiğimiz dizilerden oluşur.

4. Restriksiyon enziminin kesim bölgelerine bağlanan adaptörler ile oluşan yeni DNA parçaları amonyum asetat ve saf alkolle ile çökertildikten sonra%70’lik alkol ile yıkanarak distile su içerisinde süspanse edilir.

Ön seçici çoğaltma Seçici çoğaltma Adaptör moleküllerinin bağlandığı DNA parçalarının çoğaltılması iki aşamada gerçekleştirilir: Ön seçici çoğaltma Seçici çoğaltma

Ön Seçici Çoğaltma Bu basamakta iki primer çifti kullanılır. Bu primerler adaptör DNA’ya komplementer olup adaptör DNA’lara bağlanırlar. Bunun ötesinde bu primerlerin 3’-uçları adaptör sekansından genellikle 1 yada 2 baz daha uzundur.

Ön-Seçiçi PCR’la sadece 3’- ucunda komplementer gösteren DNA parçacıkları arttırılır. PCR genellikle 15 yada 20 döngüyle tamamlanır. AFLP’nin temeli de budur. Burada restriksiyon enzimleriyle kesilen ve adaptörlerle kapatılan DNA parçacıklarından sadece yaklaşık olarak 1/16 seçici olarak arttırılır. Diğer bir deyişle bu adımda restriksiyon- ligasyonla oluşturulan kalıp DNA’larda yaklaşık 16 kat azalma gerçekleştirilir.

SEÇİCİ ÇOĞALTMA Ön seçici PCR ürünleri bu aşamada seyreltilerek seçici PCR’da kalıp DNA olarak kullanılır. Bu aşamada kullanılan primerler ise ön-seçici PCR’da kullanılan primerlerle aynı olup 3’-ucunda genellikle 2 veya 3 nükleotid uzunluğunda fazla baz bulunur. Her bir PCR için sadece bir çift primer kullanılır. PCR genellikle 30-35 döngüde tamamlanır.

5. Bu şekilde PCR için gerekli kalıp DNA hazırlanmış olur.

6. PCR ile çoğaltılan DNA fragmentleri agaroz jel elektrofezinde yürütülür.

7. Analiz için gerekli veriler şekildeki cihazdan elde edilen grafiklerdir. Bu grafikler “AFPL skorlama” programları ile elde edilir.

AFLP SKORLAMA Geliştirilen AFLP skorlama programları, oluşan DNA fragmentlerinin matematiksel olarak ifade edilmesini sağlamaktadır. Bu şekilde oluşturulan veri bankaları, hem verilerin yorumlanmasını kolaylaştırmakta hem de sonuçların global karşılaştırılmasını sağlamaktadır.

ÖNEMİ AFLP taksonomik çalışmaları desteklemek için büyük ölçüde kabul edilmiştir. Çünkü AFLP aynı genomiğe sahip türlerin birbirleri arasındaki ilişkileri net bir şekilde açıklar. Böylece tüm canlı gruplarının sınıflandırılmasında büyük önem taşımaktadır.

AFLP’NİN KULLANILDIĞI ALANLAR: Genom haritaları, Bireysel genotipin tanımlanması, DNA polimorfizminin saptanması, Kantitatif özellik lokuslarının saptanması, Ebeveyn ve akrabaların tespiti, Hastalık ve genetik defektlerin teşhisi, Adli tıpta.

AVANTAJI DEZAVANTAJI Tek bir reaksiyonda 30-150 bölge tanımlanabilmesi, Sonuçların tekrarlanabilir olması en önemli avantajını oluşturmaktadır. Pahalı olması, Laboratuvar ekipmanına gereksinim duyulması, Dominant markör olmasıdır.

Kaynakçalar: www.google.com www.wikipedia.com www.google.com/görseller

DİNLEDİĞİNİZ İÇİN TEŞEKKÜRLER…  Ezgi ÇELİK 200920102052