PCR&REAL TIME PCR Araş.Gör.Ayhan ÜNLÜ

1953 1866 1957 1963 1972 1966 1980s 1990s 2000 DNA nın kimyasal yapısı .Bitkilerde kalıtımın esasları 1957 1963 Sanger :sekans prosüdürü. Kornberg: test tüpünde DNA. 1972 Berg:ilk recombinat DNA molekülü. 1966 Genetik kod ilk konvansiyonel DNA bazlı deneyler 1980s PCR 1990s 2000 İlk gen tedavileri insan genomunun sekanslanması Genetik gıda mühendisliği ‘Dolly’

İlk kez 1985'de bilim dünyasına sunulduğundan itibaren polimeraz zincir reaksiyonu (PCR); hem araştırmada hem de klinik laboratuarlarda tanıda yeni bir çığır açmıstır. ABD'de Cetus şirketin'de çalisan Henry A. Erlich, Kary Mullis ve Randall K. Saiki tarafindan gelistirilmistir. Metod basitçe tüpte nükleik asitlerin uygun kosullarda çogaltilmasidir. (Science,1985:230,1350). Bu bulusundan dolayi K.Mullis, 1993 yili Nobel Kimya Ödülüne hak kazanmistir.

PCR Reaksiyonu? PCR reaksiyonunda üç temel basamak vardır ve çoğaltılmış ürün miktarı, bu üç adımın tekrarına bağlıdır. Denatürasyon (90-95 °C) Primer bağlanması (50-70 °C) DNA sentezi (70-75 °C) Bu üç adım bir PCR siklüsünü oluşturur (Genetik Kavramlar S-515)

Çift zincirli DNA ısıtılarak tek zincirli hale getirilir. İlk adımda, çoğaltılacak DNA denatüre edilerek tek zincirli hale getirilir. Bu DNA temiz olmak zorunda değildir ve genomik DNA, kurumuş kan gibi adli tıp örnekleri, uzun süre saklanmış tıbbi örnekler,, tek bir saç teli, mumya kalıntıları, fosil gibi değişik kaynaklardan elde edilebilir (Genetik Kavramlar S-515) http://www2.mtroyal.ab.ca/~tnickle/3311/supplement/PCR.jpg Çift zincirli DNA ısıtılarak tek zincirli hale getirilir.

Bu primerler, kalıp DNA nın sentezi için başlangıç görevi yapar. Sıcaklık 50 ile 70 °C arasında bir değere düşürülür ve primerlerin tek zincirli hale getirilmiş DNA’ya bağlanması sağlanır. Bu primerler yapay oliganükleotidlerdir (15-30 nükleotid uzunluğunda) ve çoğaltılacak DNA kısmının uçlarındaki tamamlayıcı dizilere özgül olarak bağlanır. (Genetik Kavramlar S-515) http://www2.mtroyal.ab.ca/~tnickle/3311/supplement/PCR.jpg Bu primerler, kalıp DNA nın sentezi için başlangıç görevi yapar.

DNA polimerazın ısıya dayanıklı bir şekli reaksiyon karışımına ilave edilir ve DNA sentezi 70 ile 75 °C arasındaki sıcaklıkta gerçekleşir. (Genetik Kavramlar S-515) http://www2.mtroyal.ab.ca/~tnickle/3311/supplement/PCR.jpg Bu primerler, kalıp DNA nın sentezi için başlangıç görevi yapar.

PCR da kullanılan malzemeler Kalıp DNA Reaction buffer (x 2,5 µl) forward primer (x 0,5 µl) reverse primer (x 0,5 µl) dNTP (x 4 µl) MgCl2 (x 2,5 µl) Taq Polimraz (x 0,25 µl)

PCR’ın Sınırları Kısa ürünlerin elde edilmesi Kontaminasyona açık olma Taq DNA polymerase giderek inaktive olur. Taq DNA Polimerazin, yari ömrü 92.5°'de 130 dk; 95°C'de 40 dk'dir. Bu nedenledir ki PCR'in sonlarina dogru olan sikluslarda aktivitesi sinirlanmaktadir. Ortamda Fenol kalıntılarının bulunması PCR ı inhibe eder.

Real Time PCR Son yılllarda PCR reaksiyonlarında sıcaklık döngüleri sağlamak için kullanılan cihazların (thermocycler) hassas ölçüm aletleriyle birleştirilmesi, real-time PCR olarak adlandırılan yeni bir yöntemin gelişmesine neden olmuştur. Real-time PCR’da ürünlerin analizi reaksiyon sırasında yapılmaktadır. Bu nedenle, agaroz jel elektroforezi, DNA bantlarının mor ötesi ışık altında görüntülenmesi gibi işlemlerin uygulanmasına gerek kalmamaktadır. Real-time PCR ürünlerinin kalitatif ve kantitatif analizlerinde, diziye özgün olmayan floresan boyalardan ya da diziye özgün problardan yararlanılmaktadır.

Real-Time PCR Real-Time PCR Real-time PCR monitors the fluorescence emitted during the reaction as an indicator of amplicon production at each PCR cycle (in real time) as opposed to the endpoint detection Real-Time PCR Real-time PCR Reaksiyon esnasında her bir PCR siklüsünde yeterli miktarda ürünün verdiği floresans ışığa göre çalışıp reaksiyonu aşama aşama sonuna kadar oluşan ürünü kontrol eden bir sistemdir.

Gerçek Zamanlı PCR ( Real Time PCR ) Işıma özelliğine sahip moleküller kullanarak PCR’ı oluşurken izleme ve miktar belirleme yöntemidir.

Gerçek zamanlı PCR *Sinyal üretimi Amplikon miktarını PCR’ın linear fazında izlemek Primer/prob/amplikonların florojenik moleküllerle İşaretlenmesi *Cihaz Sinyali saptamak ve değerlendirmek Thermal cycler +Eksitasyon-Emisyon sistemleri+Bilgisayar

DNA’ya bağlanan Fluoroforlar İşaretli Oligoproblar Gerçek Zamanlı PCR DNA’ya bağlanan Fluoroforlar İşaretli Oligoproblar 5’ - eksonükleaz problar Ardışık oligoproblar “Molecular beacon” lar İşaretli primerler

GERÇEK ZAMANLI PCR Kantitasyon Erime eğrisi (Tm) analizi Multipleks uygulaması

PCR sonundaki ürünler (amplikonlar) saptanır; analiz edilir. KLASİK PCR PCR sonundaki ürünler (amplikonlar) saptanır; analiz edilir. “REAL TIME PCR” (GERÇEK ZAMANLI PCR)  PCR devam ederken ortaya çıkan ürünler saptanmaya başladığı anda değerlendirmeye alınır.

Real-time PCR’ın Prensipleri Bir flöresan röporterin kantitasyonu ve tanısı üzerine kurulu PCR ürünlerinin miktarındaki ilk önemli artış (CT - threshold cycle) hedef template’in başlangıç miktarı ile orantılıdr

Klasik PCR’da Problemler Primer seçimi ve dizaynı Termalcycler programları Reaksiyon şartları Zaman alan analiz işlemleri Bir testin optimizasyonu Agaroz jel elektroforezi, Blotlama Kontaminasyon riski

Real-time PCR’ın avantajları Spesifik olmayan amplifikasyonlardan etkilenmiyor Reaksiyon boyunca veri toplanarak aynı anda analiz imkanı PCR sonrası ürünlerin ikincil bir işlemi gerekmiyor (yüksek verimlilik,düşük kontaminasyon riski) ultra-rapid siklus (30 dak. to 2 saat) 10¹º katı bulan geniş dinamik aralık İki kat değişikliği hızla tanımlayabilmekte Spesifik erime eğrisi analizleri ile spesifik amplifikasyonların tanımlanması Duyarlılığı, özgüllüğü ve tekrarlanabilirliği yüksek Konvensiyonel PCR’dan daha pahalı değil

Real-time PCR’ın dezavantajları teknik donanım, alt yapı, beceri ve tecrübe gerektiriyor Yüksek ekipman ihtiyacı Aynı ve farklı laboratuvar’lar arasında sonuçlar arası faklılıklar Standardizasyon problemi

Real-Time PCR Tüp içinde oluşan fluorescence saptanır Amplifikasyon sırasında saptama yapılır

(www)

Real-Time PCR Systemleri Sık kullanılan Real-Time PCR Systemleri

BioRad iCycler

Corbett Research Rotor-Gene 3000

SmartCycler

MJ Research Chromo4

Idaho Technology Rapid Cycler

LightTyper & LightCycler Roche LightTyper & LightCycler

Stratagene

Stratagene

PCR’ın TEMEL FAZLARI Exponential Faz Linear Faz (yüksek farklılık) Plateu Faz (End-point)

Exponential Faz PCR ürün miktarı her siklusta tam olarak iki kat artar Reaksiyon spesifik ve tamdır Reaksiyonun Etkinliği %100 dür Reaksiyonun tüm bileşenleri tazedir.

Linear Faz (yüksek farklılık) Reaksiyonun kompanenetleri tükenmeye başlar Reaksiyon yavaşlar Oluşan PCR ürünleri değrade olmaya başlar

Plateu Faz (End-point) Geleneksel PCR larda jel bazlı tanı Reaksiyon sonlanmakta Yeni PCR ürünü oluşmamakta PCR ürünleri değrade olması artmakta

First of all we need to think about the nature of the PCR reaction in order to understand real time quantitation. The amount of DNA theoretically doubles with every cycle of PCR and this is what this shows, after each cycle the amount of DNA is twice what it was before. After one cycle of PCR, the amount of DNA is twice what it was before, so after two cycles one has 2x2 times as much, after 3 cycles - 2x2x2 times as much or 23 times as much, after 4 cycles 2x2x2x2 times as much or 24 times as much. Thus after n cycles there will be 2n times as much DNA.

But of course, the reaction can’t go on forever, and it eventually tails off and reaches a plateau phase, as shown by the figures in red. If we plot these figures in the standard fashion (top), we cannot detect the amplification in the earlier cycles because the changes do not show up on this scale. Eventually you see the last few cycles of the linear phase (pink) as they rise above baseline and then the non-linear or plateau phase (red) - in real life this starts somewhat earlier than shown here. If we plot the amount of DNA on a logarithmic scale, we can see the small differences at earlier cycles - in real time PCR we use both types of graph to examine the data. Note that there is a straight line relationship between the amount of DNA and cycle number when you look on a logarithmic scale - because PCR amplification is a logarithmic reaction.

In the following discussion the results shown will be those obtained in our laboratory using a BioRad Icycler Real-time PCR instrument. However, analysis with other instruments is similar. Here is a real-time PCR trace for a single well on a 96-well plate, cycles are shown along the X-axis, and arbitrary fluorescence units (actually these are fold increase over background fluorescence) are shown on the Y-axis - the results are similar to our theoretical graph (see insert) - except that the transition to the plateau phase is more gradual. This expt - and everything we are going to discuss - was done with SYBR green, which has very low fluorescence in the absence of double stranded DNA and very high fluorescence in the presence of double stranded DNA.

Floresan Prob Sistemleri Hidrolizasyon problar (TaqMan (PE Biosystem), Beacons, Scorpions) Hibridizasyon problar (Light Cycler (Roche) DNA’ya bağlanan (binding) boyalar (SYBR Green)

LightCycler sisteminin bir uygulamasında; yalnızca çift zincirli DNA’ya bağlandıklarında floresans veren boyalar (Cyber green I) kullanılarak, amlifikasyona bağlı DNA artışı, ortaya çıkan floresansın miktarı ile ölçülmektedir. Primerin bağlanmasını takiben gerçekleştirilen uzama aşamasında hedef DNA’nın çift sarmal hale gelmesiyle DNA’ya bağlanan “cyber green” miktarı artmakta ve buna bağlı olarak yayılan floresans miktarında artış gözlenmektedir.

SYBR Green (çift zincirli DNA ya bağlanmakta) çift zincirli DNA ya bağlandıkları sürece floresan emisyonu olmakta Spesifik olmayan bağlanmalar gerçekleşmekte yoğun optimizasyona ihtiyacı yok

Taqman LightCycler’ın diğer bir uygulama şekli, hedefe özgül problar kullanmaktır. Burada problarla testin özgüllüğü artırılmıştır. Problardan biri 3’ ucundan floresans boya ile işaretli (donör boya), diğeri 5’ ucundan alıcı boya (acceptor dye) ile işaretlenmiştir. Problar hedef amplikonlar üzerinde birbirine yakın (1-5 nükleotit uzaklıkta) yere bağlanmakta ve işaretli uçlar yan yana gelmektedir. İki boyanın yan yana gelmesiyle açığa çıkan enerji ikinci prob üzerindeki alıcı boyayı etkileyerek floresans oluşumuna yol açmaktadır. “Fluoresance resonance energy transfer, (FRET)” olarak adlandırılan bu enerji transferi sonucunda oluşan floresans miktarı, ortamdaki hibridizasyonun derecesine diğer bir ifade ile PCR siklusu süresince oluşan amplikonların miktarına bağlı olarak artmaktadır.

TaqMan sisteminde 5’ ve 3’ uçlarından florokrom maddelerle işaretli prob kullanılmaktadır. Prob’un 5’ ucunda raportör florokrom (6-carboxyfluorescein =6-FAM), 3’ ucunda ise baskılayıcı florokrom (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine =TAMRA) bulunmaktadır. Prob, tek sarmal hale getirilen hedef molekül üzerinde, primerlerin bağlanma bölgesinin arasında kalan yere bağlanır. Prob-hedef molekül arasındaki hibridizasyon devam ettiği sürece raportör florokrom maddenin sinyal oluşturması, 3’ uçtaki baskılayıcı florokrom tarafından engellenmektedir. Primerlerin hedef nükleik asite bağlanmasını takiben başlatılan primer uzaması prob’un bağlandığı noktaya kadar geldiğinde, sentezin devam edebilmesi için Taq DNA polimeraz enzimi 5’→3’ nükleaz aktivitesini kullanarak probu 5’ uçtan yıkmaya başlar. Böylece raportör florokrom serbest hale geçer ve sinyal oluşturur (Şekil 5). Her siklusta üretilen amplikon miktarına paralel olarak sinyal şiddeti de artmaktadır

Fluorescent Resonant Energy Transfer TaqMan FRET Fluorescent Resonant Energy Transfer

Nigel Walker, NIEHS (www)

Spesifite TaqMan Yüksek spesifiklik SYBR Green Düşük spesifite

Molecular Beacons

real-time real-time molecular beacons real-time real-time A B C Excitation Reporter Non-fluorescent Quencher FRET ANNEALING MB have three main components to the hairpin structure: A. A sequence specific loop B. An homologous stem structure 3. A 5’ reporter and a 3’ quencher molecule Amplicon

Scorpion Figure 1. Scorpion probing mechanism. Step 1: initial denaturation of target and Scorpion stem sequence. Step 2: annealing of Scorpion primer to target. Step 3: extension of Scorpion primer produces double-stranded DNA. Step 4: denaturation of double-stranded DNA produced in step 3. This gives a single-stranded target molecule with the Scorpion primer attached. Step 5: on cooling, the Scorpion probe sequence binds to its target in an intramolecular manner. This is favoured over the intermolecular binding of the complementary target strand.

Yeni Prob Sistemleri Peptide nucleic acids (PNAs) nükleikasit anologları (Tm 15) Minor Groove Binding (MGB) Locked Nucleic acid (LNA) Oligonüklotid riboz anoloğları

Threshold Cycle threshold cycle veya CT değeri DRn de önemli artışın olduğu ilk siklusu ifade eder

nedir CT?

DRn = (Rn+)- (Rn-) (normalize reporter signal) Rn+ Templatide içeren reaksiyona giren tüm komponentlerin floresan emisyonu Rn- negatif kontrolün (pasif Boya) ve reaksiyone olmayan örneklerin floresan emisyonu DRn Rn+ ve Rn- arasındaki fark olup CT Değerinin hesaplanmasında kullanılan temel göstergedir

Nedir DRn? +Rn Rn Rn -Rn CT cycle number Sample Threshold No Template Control CT 10 20 30 40 cycle number

(www)

Geri (“Revers”) Transkripsiyon PCR RNA PCR olarak ta bilinen RT-PCR iki aşamalı olup RNA’dan tamamlayıcı DNA sentezi (geri transkripsiyon) ve tamanlayıcı DNA(cDNA)’nın da standart PCR yoluyla çoğaltılması aşamalarını kapsar.RT-PCR tek aşamalı bir reaksiyonla da gerçekleşebilir. T.thermophilus (Tth) DNA polimerazı gibi bazı polimerazlar mangan varlığında hem RNA hem de DNA kalıp ipliklerini kullanabildiğinden tüm işlem aynı tüpte tek aşamada yapılabilmektedir. RT-PCR, mRNA veya viral RNA miktarlarının belirlenmesi ile RNA düzeyinde gen anlatımında oldukça duyarlı bir yöntemdir.

“IN SITU” PCR PCR ile ilgili çalışmalarda diğer önemli bir aşama, lam üzerine tespit edilen enfekte hücrede bulunan mikroorganizmaya ait hedef DNA’nın amplifikasyonu ve sonucun “in situ” hibridizasyon ile gösterilmesidir. Kısaca; lam üzerine doku veya hücreler konduktan sonra, havada kurutulur ve 105°C’de 30 saniye bekletilir. Paraformaldehitli fosfat tamponlu tuzlu su (%2’lik) ile bir saat işleme alınır. 3 x 0.1 M PBS (Phosphate buffer saline) ile bir kere, 1 x 0.1 M PBS ile üç defa yıkanır. Proteinaz K enzimi (5 μg/ml) ile 55°C’de iki saat muamele edildikten sonra, 96°C’de iki dakika tutularak Proteinaz K inaktive edilir. Lam su ile yıkanır ve havada kurutulur. Sonra lamın üzerine amplifikasyon solüsyonu eklenir ve plastik kapakla kapatılır. Plastik kapağın etrafı oje ile çevrilir. Lam, otomatik termal “cycler” üzerine konulur. Aluminyum kağıt ile kapatıldıktan sonra amplifikasyon başlatılır. Amplifikasyondan sonra lam absolü etil alkol içinde 3-5 dakika tutulur. Sonra 92°C’de 30 saniye denatürasyon sağlanır ve 2 x SSC (Sodyum klorür + Sodyum sitrat)tamponu ile yıkanır. Bunu takiben özgül problarla “in situ” hibridizasyon yapılarak amplifikasyon sonucu gözlenir

ÇALIŞMA RAPORU G-Aktin yapımı G-aktin tamponu hazırandı. - 5 mM K-Fosfat - 0,5 mM ATP - 0,1 mM CaCl2 - 0,5 mM DTT - 1 mM NaN3 Hazırlanan tamponun içinde Tavşanın çizgili kas hücrelerinden elde edilen lifler 4-5 saat manyetik karıştırıcıda çözülür. Çözülen örnek Tülbent bezden süzüldükten sonra 0,5 lik filtreden geçirildi. Elde edilen örneklerin hacmine göre 10 mM NaCl ve 3 mM MgCl2 eklenerek gece polimerleşmeye bırakıldı.

Aktin Yapımı 5) Örnekler 80.000 x g de 4 saat santrafüj edildi. 6) Pelet alınır ve üzerine 2,5 ml depolimerleşme tamponu eklenir ve vortex ile pelet tampon içinde çözüldü. 7) 29.000 x g de 45 dakika santrifüj edilen örneklerden süpernatant alınır. 8) Alınan örnek G aktin tamponunda 4 saat dialize yatırılır. 9) Dializ edilen örnekler elektroforez yapılarak G-aktinin oluşup oluşmadığı gözlendi.

G-Aktin den F-Aktin eldesi Elde edilen aktine 10 mM NaCl ve 3 mM MgCl2 eklenerek polimerleşmeye bırakıldı Polimerleşme sırasında 0, 5, 10, 20, 60 dakilarda örneğin vizkosluğu ölçüldü.

Bakteriden EF-2 Eldesi 1. Daha önceden 180° C'de 2 saat kuru etüvde otoklavlanan cam kap içine 100 ml LS (50 ug/ml ampisilin) kondu. Bug'dan pipet ucuyla alınarak, 100 ml LB (w/amp) içine kontamine edildi. Gece boyunca 37° C'de shakerda sallanmaya bırakılacakdı. 2. Ertesi sabah önceden otoklavlanmış cam kaplar içine 500 ml LB (w/ampisilin) kondu. Gece boyunca çoğalan bakterilerden her 500 ml'ye 1 ml gelecek şekilde konulduktan sonra 37 C'de shakerda sallanmaya bırakıldı. 3. Çoğalan bakterinin yarım saatlik zaman dilimlerinde 600 nm'de OD değerleri ölçüldü. OD değeri 600 nm dalga boyunda 0,5 - 0,6 değerine ulaşınca 0.1 mM olacak şekilde IPTG ve 20 ug/ml olacak şekilde 500 ml ampisilinli LB medyumu içerisine 2 ul chloroamphenicol eklendi. IPTG ve cloroamphenicol eklemeden hemen önce daha sonra poliakrilamid jelde kontrol edebilmek amacıyla 0. saat için 1 ml örnek alındı. 4. Shaker'da 25 C'de 4 saat boyunca inkübasyona bırakıldıktan sonra, 4. saatin sonunda poliakrilamid jelde kullanmak üzere 1 ml örnek alındı. 5. Buz içinde konulan veya santrifüj godelerine aktarılan bakteriler 3500 rpm'de 4 C'de 10 dakika boyunca santrifüj edilip bakterilerin çökmesini sağlandıktan sonra 2 ml lyzis bufferda çözüldü. 6. Sonikatörde buz içindeyken 40-60 saniye kadar süt beyazı rengine olana dek tutulup daha sonra -20 C'ye kaldırıldı. 7. Poliakrilamid jelde O. saat ve 4.saat için aldığın örnekleri yürütüp coommassie boyama yaparak protein elde edilip edilmediğini kontrol edildi. 8. istenen protein poliakrilamid jelde görüldükten sonra, pürüfikasyon aşamasına geçildi.