400100710151-MOLEKÜLER MARKÖRLER VE BİTKİ ISLAHINDA KULLANIMI http://biotek.ankara.edu.tr/ 400100710151-MOLEKÜLER MARKÖRLER VE BİTKİ ISLAHINDA KULLANIMI Prof. Dr. Ali ERGÜL Ankara Üniversitesi, Biyoteknoloji Enstitüsü

Hafta-1 Tarım Bitkileri, Biyoçeşitlilik, Transgenik Bitkiler Hafta-2 Nükleik Asit İzolasyonu (DNA) Hafta-3 Nükleik Asit İzolasyonu (DNA)-UYGULAMA Hafta-4 PCR (Polimerase Chain Reaction) Hafta-5 PCR (Polimerase Chain Reaction)-UYGULAMA Hafta-6 Kapiller Elektroforez Hafta-7 Moleküler Markörler ve SSR (Simple Sequence Repeats) Hafta-8 Kapiller Elektroforez - UYGULAMA Hafta-9 SNP Markırlar, Yeni Nesil Sekanslama Teknikleri ve SNP Haplotiplemesi Hafta-10 DNA Barkodlama Hafta-11 Markıra Dayalı Seleksiyon (MAS) Hafta-12 Haritalama Yaklaşımları Hafta-13 Dizi Analizi Hafta-14 Dizi Analizi-UYGULAMA

Hafta 2: Nükleik Asit izolasyonu (DNA)

Doku: değişik dokulardan(nuclear ve organel DNA lar) Doku durumu: genç dokular Doku hazırlığı: sıvı azot tercih edilerek çalışılmalı, dokunun doğru şekilde parçalanması Çalışma koşulları: Dnase bulaşık olmaması +4C çalışma koşulları

DNA izolasyonu aşaması İzolasyon buffer: genellikle pH:8(Tris-HCl vb) Tuz(NaCl vb): Proteini-DNA dan uzaklaştırma Deterjan(SDS, sarkosyl vb): hücre membranlarının gerçirgenliğini (çözünürlüğünü) artırmak EDTA Mg iyonlarını çöktürür, (tutar)(Mg iyonları DNAse aktivitesini artırır) Protein denaturantlar (phenol, kloroform vb) Protein uzaklaştırıcılar: Fenol, kloroform veya protease (proteinase K vb) Polysakkaritlerin uzaklaştırılması(CTAB)

DNA izolasyonu sonrası DNA spektrofotometrik ve görsel olarak belirlenir(spec., nanodrop veya moleküler ağırlığı(MW) bilinen DNA lar kullanılır). Spec. uygun seyreltmeler yapılır(DNA:Su =5:95, 2:98 gibi)

Hesaplamalarda miktar (A260) Spec. A260(ug/ml=ng/ul) Spec. okumasıXSeyreltme faktörüX50 saflık (A260/280) A260/280: 1.8-2.0

Saklama koşulları Kısa süreli: -20 C Uzun süreli –80 C

Protokol Lefort, F., Lally, M., Thompson, D., Douglas, G.C. 1998. Morfolojical traits microsatellite fingerprinting and genetic relatedness of a stand of elite oaks(Q. Robur L.) at Tuallynally, Ireland. Silvae Genetica 47, 5-6. 1. 100mg yaprak dokusuna, 1 ml DNA ekstraksiyon solusyonu* eklenir (örnek başına 10 µl 2-Merkaptoethanol içerir) 2. Örnekler 65 ˚C – 15 dk su banyosunda arası çalkalayarak bekletilir. Daha sonra oda koşullarına soğutulur. 3. Üzerine 0.7 ml kloroform/ isoamil alkol (24:1) eklenerek 20-25 defa sallanır. 30 dk buz üzerinde bekletilir. 4. 10 dk. 14.000 rpm de santrifüj edilir. 5. Üst sıvı (süpernatant) (~0.7 ml) yeni bir tüpe aktarılır. 6. Üzerine ~0.8 ml isopropanol eklenir. 7. 15-20dk. buz üzerinde bekletilir (Tercihen -20˚C de gece boyu bekletilebilir). 8. 3 dk 14.000 rpm de santrifüj edilir.

Protokol 9. Üst sıvı atılır. 10. Alt katı (pellete) üzerine 1 ml (70 %) ethanol eklenir ve 2 dk. 14.000 rpm de santrifüj edilir. 11. Ethanol uzaklaştırılarak pellet kurtulur ve 50-100 µl TE (pH 8) veya H2O (nuclease free) da cözülür (pipetajla pellet oynatılır, gece boyu 4˚C de tutularak DNA 'nın çözülmesi sağlanır) 12. 100 µl DNA için 3 µl RNase eklenir. 37 ˚C de 20 dk bekletilir.   DNA ekstraksiyon solusyonu*

Ders KapsamındaYaralanılan Kaynaklar Andrews, K. R., Good, J. M., Miller, M. R., Luikart, G. ve Hohenlohe, P. A. 2016. “Harnessing the power of RADseq for ecological and evolutionary genomics”, Nature Reviews Genetics, 17(2), 81. Biotechnology of Fruits and Nut Crops (Editor:R. E. Litz)(2005) Genome Mapping and Molecular Breeding in Plants(Fruits and Nuts) (Editor:Chittaranjan Kole)(2007) Genomics-Assisted Crop Improvement, Volume 1(Editor: Rajeev K. Varshney, Roberto Tuberosa) (2007) Model Plants and Crop Improvement(Editors: R. K. Varshey, R. M. D. Koebner)(2007). Plant Molecular Breeding (Editor: H. John Newbury)(2003) Thomson, M. J., Zhao, K., Wright, M., McNally, K. L., Rey, J., Tung, C. W., Reynolds, A., Scheffler, B., Eizenga, G., McClung et.al. 2012. “High-throughput single nucleotide polymorphism genotyping for breeding applications in rice using the BeadXpress platform”, Mol. Breed., 29, 875-886.