400100710151-MOLEKÜLER MARKÖRLER VE BİTKİ ISLAHINDA KULLANIMI http://biotek.ankara.edu.tr/ 400100710151-MOLEKÜLER MARKÖRLER VE BİTKİ ISLAHINDA KULLANIMI Prof. Dr. Ali ERGÜL Ankara Üniversitesi, Biyoteknoloji Enstitüsü

Hafta-1 Tarım Bitkileri, Biyoçeşitlilik, Transgenik Bitkiler Hafta-2 Nükleik Asit İzolasyonu (DNA) Hafta-3 Nükleik Asit İzolasyonu (DNA)-UYGULAMA Hafta-4 PCR (Polimerase Chain Reaction) Hafta-5 PCR (Polimerase Chain Reaction)-UYGULAMA Hafta-6 Kapiller Elektroforez Hafta-7 Moleküler Markörler ve SSR (Simple Sequence Repeats) Hafta-8 Kapiller Elektroforez - UYGULAMA Hafta-9 SNP Markırlar, Yeni Nesil Sekanslama Teknikleri ve SNP Haplotiplemesi Hafta-10 DNA Barkodlama Hafta-11 Markıra Dayalı Seleksiyon (MAS) Hafta-12 Haritalama Yaklaşımları Hafta-13 Dizi Analizi Hafta-14 Dizi Analizi-UYGULAMA

Hafta 10: DNA Barkodlama

DNA Barkodlama İlk kez 2003 yılında kullanılan ‘DNA Barkodlama’ kavramı , temel olarak DNA dizi analizi temeline dayanmakta olup, kullanılan birkaç standart lokus yardımı ile türlerin tanımlamasını ve ayrımını sağlamaktadır. Özellikle son yirmi yılda hızlı gelişme gösteren bitki moleküler sistematiği çalışmalarında, kloroplast DNA’sı ve yüksek oranda tekrarlı nüklear ribozomal DNA gibi standart lokusları içeren moleküler araştırmalar ön plana çıkmıştır.

DNA Barkodlama Evrensel tek bir primer çifti ile çift yönlü olarak kolay dizilenebilen ve yüksek seviyede tür ayrımına olanak sağlayan özelliklere sahip barkod bölgesi ideal barkod bölgesi olarak tanımlanmaktadır. Bitkilerde, ITS, matK, rbcL, trnH–psbA gibi bir çok barkod gen bölgesi bulunmasına rağmen, filogenetik ayrım gücüne yönelik bir ideal barkod derecelendirmesi yapılmamıştır (CBOL Plant Working Group, 2009). Ancak bir çok çalışmada kodlama yapan ve yapmayan kloroplast gen bölgeleri ve ribozomal ITS bölgeleri popüler bölgeleri olarak ön plana çıkmaktadır.

DNA Barkodlama Bitkiler ve insanlar başta olmak üzere tüm organizmalarda gerçekleşen protein sentezi ile ilişkili rDNA’lar özellikle canlılar arasındaki evrimsel benzerlik ve ilişkinin tanımlanmasında temel olarak kullanılmaktadır. rDNA’ da küçük rDNA geni (18S vb.), 5.8S rDNA geni ve büyük rDNA geni (28S vb.) olmak üzere 3 rDNA geni bulunmaktadır.

DNA Barkodlama rDNA’nın ITS (Internal Transcribed Spacer) bölgeleri, bitkilerdeki moleküler sistematik çalışmalarda sıklıkla tercih edilen yöntemler arasında olup rDNA bölgeleri genomik DNA’nın NOR (Nükleolar Organize Region) bölgelerinde, ardışık tekrarlı diziler halinde bulunmaktadır. rRNA, 18S küçük alt birim (Small Sub Unit), 5.8S ve 28S büyük alt birim (Large Subunit)’ den oluşmaktadır.

DNA Barkodlama ITS bölgeleri rDNA’ nın alt birimleri ile transkribe edilmekte olup, korunmuş bölgeleri ayıran ITS1 ve ITS2 olmak üzere 2 bölgeden oluşmaktadır. Bunlardan ITS1; 18S (SSU) ile 5.8S, ITS2 ise; 5.8S ile 26S genleri arasında yerleşmiş haldedir. ITS1 ve ITS2 bölgeleri ribozomal alt birimlerin yapısına katılmamakta ancak rRNA’ ların olgunlaşma sürecinde görev almaktadır. Transkripsiyon sonrası preRNA moleküllerinin olgun RNA moleküllerine dönüşmesi sürecinde, ITS1 ve ITS2 bölgeleri kesilmekte bu nedenle herhangi bir baz değişimine uğramamaktadır. Bu durum ITS bölgelerine dayalı birçok moleküler filogenetik çalışmalarla kanıtlanmış durumdadır.

DNA Barkodlama Bitkide kloroplast DNA’sı halkasal yapıda olup, yaklaşık 60-80 gen içermekte ve intronlar, kodlama yapan bölgeler ve kodlama yapmayan bölgeler olarak 3 grup içermektedir. Özellikle nüklear genoma oranla daha fazla sayıda kodlanmayan bölgeye sahip olması kloroplast genomunun çok yavaş evrimsel değişime uğramasına neden olmaktadır. Bu özelliğinin yanında kloroplast genomunun rekombinant özellikte olmaması haploid (n) yapıda olması ve genellikle uniperantal olarak (anneden) aktarılması gibi özellikleri bu genomun filogenetik çalışmalarda tercih edilmesine neden olmaktadır.

DNA Barkodlama Kloroplast DNA’sı temelli yapılan filogenetik çalışmalarda genellikle ribilose-1,5- bisphospate carboxylase (rbcL rubisco) gibi iyi tanımlanmış genler kullanılmaktadır. matK bölgesi de yine bitkilerde en çok çeşitlilik gösteren kloroplast genomundaki kodlama bölgelerinden biridir. Özellikle rbcL ve matK genleri çok yavaş evrimselleşmekte bu nedenle bitki filogenetik araştırmalarda özellikle cins ve cins üstü taksonomik seviyelerin ayrımında önemli kaynak oluşturmaktadır.

DNA Barkodlama DNA Barkodlama Çalışmalarında Kullanılan Gen Bölgelerinin Kombinasyonları: Anlatılan bu ve benzeri araştırmalardan da anlaşılacağı üzere bu bölgelere ait kullanılan markırlardan farklı kombinasyonlar filogenetik analizlerde farklı düzeyde ayrım seviyeleri oluşturabilmektedir.

DNA Barkodlama Acanthaceae familyasında, trnL-F’nin rbcL bölgesine oranla iki kattan fazla bilgilendirme potansiyelinin olduğu açıklanmış ve özellikle trnL-F’ nin filogenetik tanımlamalarda yüksek oranda bilgi verici olduğu belirtilmiştir. Buna karşın Asphodelaceae familyasında kodlamayan bölgeler arasında (rbcL ve trnL-F) bilgilendirme açısından önemli derecede farklılık bulunmadığını açıklanmıştır .

DNA Barkodlama Başka bir çalışmada ise kloroplast DNA’ da yer alan kodlanmayan bölgelerin özellikle düşük taksonomik seviyelere sahip analizlerlerde net ayrım yaptığı açıklanmıştır. Thymelaeaceae familyasına ait 27 cins ve birkaç dış grup taksonunda yapılan çalışmada ise, kloroplast kökenli rbcL, trnL intron ve trnL-F bölgelerine ait dizi analizleri sonucunda her bölge ayrı ayrı birbirine paralel filogenetik veriler vermiştir.

DNA Barkodlama Ancak çalışmada analiz verilerinin netliğinin arttırılması amaçlı rbcL ve trnL dizi bölgesine ait veriler birleştirilmiş ve özellikle trnL-F’ inthan rbcL bölgesine oranla daha değişken özellikte olduğu açıklanmıştır .

DNA Barkodlama ITS markırlarının, Dirca occidentalis ve diğer bitki türlerine ait genotiplerde mevcut genetik varyasyonu yeterli derece çözümleyemediği belirtilmesine karşın ITS, matK ve trnH-psbA dizilerinin kullanıldığı incir (Ficus carica) örneklerinde, ITS dizileri yüksek varyasyon oranları gösterirken, matK dizileri ile yapılan filogeni analizlerinde ise matK dizileri, çözülen monofiletik (tek bir soydan gelen) gruplarda ise en yüksek ayrım yüzdesini göstermiştir.

DNA Barkodlama Filogenetik analizler sonucunda ITS bölgesi ve psbA-trnH ve matK ve psbA-trnH dizileri arasında önemli korelasyon varlığı saptanırken, ancak ITS ve matK dizileri arasında herhangi bir ilişki durumu gözlemlenmemiştir. Çalışmada, ITS + matK ve ITS + matK + psbA-trnH ile oluşturulan markır kombinasyonları filogenetik çözünürlük açısından en yüksek yüzdeyi vermiştir.

Ders KapsamındaYaralanılan Kaynaklar Andrews, K. R., Good, J. M., Miller, M. R., Luikart, G. ve Hohenlohe, P. A. 2016. “Harnessing the power of RADseq for ecological and evolutionary genomics”, Nature Reviews Genetics, 17(2), 81. Biotechnology of Fruits and Nut Crops (Editor:R. E. Litz)(2005) Genome Mapping and Molecular Breeding in Plants(Fruits and Nuts) (Editor:Chittaranjan Kole)(2007) Genomics-Assisted Crop Improvement, Volume 1(Editor: Rajeev K. Varshney, Roberto Tuberosa) (2007) Model Plants and Crop Improvement(Editors: R. K. Varshey, R. M. D. Koebner)(2007). Plant Molecular Breeding (Editor: H. John Newbury)(2003) Thomson, M. J., Zhao, K., Wright, M., McNally, K. L., Rey, J., Tung, C. W., Reynolds, A., Scheffler, B., Eizenga, G., McClung et.al. 2012. “High-throughput single nucleotide polymorphism genotyping for breeding applications in rice using the BeadXpress platform”, Mol. Breed., 29, 875-886.