DNA DİZİ ANALİZİ

DNA dizi analizi ya da "Sequencing" DNA'nin nükleotid dizilerinin saptanması anlamına gelmektedir. İlk yöntemler, proteinlerdeki aminoasit dizilerinin saptanmasındakilere dayanıyordu.İlk dizi analizi, 1960'larin başında 75-80 nükleotid kapsayan küçük tRNA'lar ile başlamıştır. Maya alanine tRNA molekülünün 1964'de dizi analizinin yapılması ile moleküler biyolojide önemli bir adim atılmıştır. Ancak bunlar zor ve zaman alıcı olduğu için farklı yöntemler geliştirilmiştir. Prokaryotik organizmaların (bakteri), faj, virus ve plasmidlerin DNA'larında bulunan Nükleotid dizilerinin belirlenmesinde iki temel teknik geliştirilmiştir. Bunlar; -Maxam-Gilbert kimyasal degradasyon yöntemi ile -Sanger'in dideoksi enzimatik yöntemidir.

Sanger Metodu, Frederick Sanger (1975) tarafından geliştirilmiş ve dideoksinukleotid olarak adlandırılmıştır(enzimik metod). Bu metotla, Sanger, küçük DNA fajlarından olan øX174 fajının 5386 baz çiftinden (bp) oluşan genomunun nukleotid sıralarını saptamıştır (sequencing). Baz sıralarını saptamada diğer bir metod da A.M.Maxam ve W.Gilbert'e (1977) aittir (kimyasal metod). Bu araştırıcılar da SV40 virusunun baz sekanslarını belirlemişlerdir (5226 bp). Greg Sutcliffe (1979), Gilbert'in laboratuvarında aynı tekniği uygulayarak pBR322 plasmidinin baz sıralarını tespit etmiştir (4362 bp). bu gün, DNA baz sıralarının saptanması, geliştirilen yeni aletler yardımıyla otomatik olarak kolay, doğru ve kısa bir süre için de (bir günde binlerce baz) yapılabilmektedir (automatic DNA sequencing).

Sanger ve Maxam-Gilbert yönteminde üç ana aşama bulunur. Bunlar; dizi analizi yapilacak DNA'nin hazirlanmasi, reaksiyonlar ve yüksek voltaj jel elektroforezi

Her iki yöntemde de dizisi saptanacak DNA’ya dört ayrı reaksiyon uygulanmaktadır(her baz için bir tane) Bu dört reaksiyonun ürünleri, bir nükleotit uzunluğu kadar farklı, bir dizi DNA parçalarıdır. Dört reaksiyonun ürünleri bir jelde dört ayrı kuyucukta ayrıştırılmaktadır Jel hattındaki her bir bant belirli bir baza karşılık gelmektedir ve jeldeki bantlardan DNA parçacığının dizisi okunabilmektedir.

SANGER METODU Sanger metodunun prensibi tek zincirli DNA kalıbının tamamlayıcı zincirinin DNA polimeraz enzimi ile 5’ den 3’ ne doğru sentezlenmesi işlemine dayanır. Dizisi saptanacak olan DNA zinciri yeni sentezlenecek DNA zinciri için kalıp olarak kullanılır Sentez reaksiyonu DNA polimeraz I ile kataliz edilir Kimyasal değişikliğe uğratılmış(modifiye) dideoksinükleotit trifosfatlar kullanılarak bir dizi DNA parçacıkları elde edilir Dideoksinükleotit trifosfatlarda 3’- OH gurubu bulunmaz. Bu durumda, molekül yeni sentezlenen DNA’ ya katılır ancak 3’-OH grubu taşımadığı için kendisine nükleotit ilave edemez ve zincir sentezi sonlanarak bir DNA parçacığı elde edilir

deneyde 4 reaksiyon karışımı hazırlanır Herbir reaksiyon karışımı kalıp DNA zinciri(tekzincirli), bir primer, DNA polimeraz, radyoaktif trifosfatların dördü(4 nükleotit) ve az miktarda dört tip dideoksiribonükleozit trifosfatlardan sadece birini içerir Zincir sonlanması için dört reaksiyon tüpünde farklı bir dideoksinükleozit trifosfat bulunur DNA polimeraz, arada sırada,uzayan DNA zincirinin yapısına nükleotitlerin yanı sıra dideoksinükleotitleri de sokar.bu nükleotit anoloğu 3’ hidroksil grubu içermediği için bir sonraki nükleotit ile 3’ bagı oluşturamaz ve bu nedenle DNA sentezi sonlanır Reaksiyonların herbirinde çok az miktarda modifiye nükleozit kullanıldığı için yeni zincir sentezi rastgele sonlanarak, bir dizi DNA parçacığı meydana gelir

Her bir tüpte uzunlukları birbirinden birer nükleotit farklı olan, değişik uzunluklardaki DNA molekülleri birikir. Sentez sonrası, dört reaksiyondan elde edilen radyoaktif DNA parçacıkları elektroforez jelinde yan yana dört ayrı kuyucukta yürütülür DNA bantları otoradyografi ile görüntülenir ve jel aşağıdan yukarıya doğru okunarak nükleotit dizisi saptanır

TGCAATCG…

TTCGTGAAG…

Maxam-Gilbert yöntemi Dizisi saptanacak DNA parçacığının komplementer zincirleri ayrılıp zincirlerden biri kullanılır. Dizisi saptanacak zincir 5’- ucundan, polinükleotit kinaz enzimi kullanılarak radyoaktif P32 ile işaretlenir. Bu işaret, elektroforez sonrası belirli bir DNA parçacığının tanınmasını sağlamaktadır İşaretlenen DNA parçası dört örnek olarak bölünür Dört ayrı tüpteki DNA örneğine, zinciri belirli nükleotitlerden kıran dört ayrı kimyasal reaksiyon uygulanır Her tüpte farklı pozisyonlardaki hedef nükleotitlerden kırılmış moleküller elde edilir Sonuçta, kırıldığı noktaya göre hepsi 5’ ucundan işaretli ancak boyları farklı bir dizi parçacık elde edilir.

DNA nın kırıldığı dört farlı reaksiyonda, guaninden(G>A), adeninden(A>G), yalnız sitozinden ve timinden(C+T) kırılma olur Bu reaksiyonlarda, purinlerin kırılmasında dimetilsülfat kimyasalı kullanılır Bu reaktif, adenine göre guanini daha etkin olarak metiller ve ısı uygulandığında zincir metillenmiş bölgeden kırılır. Bu durumda daha çok guaninden zincir kırılması gerçekleşir(G>A) Asit ortamda ise bunun tersine adeninden kırılan zincirler daha fazladır(A>G)

Primidinlerin kırılma reaksiyonunda hidrazin kullanılır Hidrazin DNA’ yı hem sitozin hemde timinden kırar. Ancak yüksek tuz derişiminde(2M NaCl) yalnız sitozin reaksiyona girer. Böylece iki reaksiyondan biri sitozini(C )diğeri sitozin ve timini (C+T) belirlemektedir

Dört reaksiyon setinden elde edilen parçacıklara elektroforez uygulanarak jel üzerinde yan yana yürümeleri sağlanır Reaksiyonların herbiri hedef bazdan kırılmış ancak farklı uzunlukta parçacıklar içermektedir Uygulanan elektriksel alanın etkisiyle farklı uzunluktaki parçacıklar jelde en kısası önde gitmek üzere yol alır

DNA parçacıklarının 5’ ucu radyoaktif işaretli olduğu için, elektroforez sonrası jelin üzerine rontgen filmi konularak otoradyografi yapılır Görüntülenen bantlar dört hat boyunca aşağıdan yukarıya doğru okunur

GCGG…

OTOMATİK DNA DİZİ ANALİZİ Genomların dizi analizi için,otomatik DNA dizi analizi aletleri ve radyoaktif izotop yerine floresan boyalar kullanılır. Bu sistemde 4 farklı renkte boya kullanılır ve sonuçta, dizinin okunmasını sağlayan dört farklı renkteki piklerin oluşturduğu bir model ortaya çıkar

DNA dizi analizi Genlerin organizasyonu, doğası Mutasyonların sayısı, yeri ve çeşidi Prokaryotik ve ökaryotik genlerde yer alan kontrol bölgelerinin organizasyonu Proteinlerin aminoasit dizileri İle ilgili bilgi verir. Ayrıca nükleotit dizlerinin bilgisayar analizleri, klonlanmış parçanın bir genin tamamı mı yoksa bir kısmını mı içerdiğinin anlaşılmasını sağlar. Bu ekzon/intron birleşme noktalarının araştırılması ile ve çeşitli verilere göre daha önceden ortaya çıkarılmış genlerin DNA dizileri ve proteinlerin aminoasit dizileri ile karşılaştırılarak yapılır.

DNA dizi analizi, genlerin organizasyonu(intron ve ekzonların sayısını ve intron-ekzon sınırlarını) belirlemek, genin ürünü olan proteinin yapısı ve görevi hakkında bilgi edinmek ve diğer organizmalardan elde edilen benzer proteinler arasındaki evrimsel ilişkiyi ortaya çıkarmak amacıyla da kullanılır DNA dizi analizi ile virüslerin tüm genomları, E.coli ve maya gibi birçok organizmanın genomları aydınlatılmıştır. İnsan haploit genomunda bulunan 3 milyar bazın dizi analizi için Amerika Birleşik Devletleri Enerji Departmanı ve Ulusal Sağlık Enstitüsü birlikte çalışmaktadır.

DİĞER DNA DIZI ANALIZI YÖNTEMLERİ Radyoaktivitenin zararlari, pahaliligi gibi dezavantajlarini ortadan kaldirmak amaciyla, nonradyoaktif yöntemler gelistirilmistir. Bunlar: a. Gümüs boyama teknigi: Gümüs boyamanin, DNA dizi analizinde kullanilmasi basit,hizli ve ucuz bir teknik olarak göze çarpmaktadir. b. Biotinlenmis primer kullanilmasi c. Otomatik cihaz yardimiyla flöresans isaretleme ile DNA dizi analizi gerçeklestirilir d. Magnetik parçaciklar kullanarak DNA dizi analizi. e. DNA baglayan proteinlerle. f. Digoxigeninle DNA dizi analizi.