Ders, mikrobiyolojik tanıda serolojik ve moleküler teknikler ile ilgili yapılacak laboratuvar uygulamasının temel bilgilerini vermektedir. Dersin ilk kısmı bugün ve son kısmı gelecek derste işlenecektir.

DİKKAT ! Söz konusu laboratuvar uygulaması üç adet pratiğe bölünmüştür. Pratiklerden not alabilmek için her üç pratik çalışmasının hepsine katılmak ve bunlardan türeyen bilgilerle ortak tek adet laboratuvar raporu sunmak gerekmektedir. Üç pratikten bir veya ikisi eksik öğrenci laboratuvar raporu sunamaz, bu nedenle pratiklerin hiçbirinden not alamaz. İlgili duyuru 6. Kurul Yürütme Komitesi tarafından vebe konmuştur. Pratik telafisi TRAKYA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ EĞİTİM-ÖĞRETİM VE SINAV YÖNETMELİĞİ‘nde belirtildiği gibi sadece Üniversite temsili veya YÖK görevlendirmesi durumlarında uygulanır. Bunlar dışındaki mazeretlerde pratik telafisi yoktur. Öğrenci laboratuvara beyaz önlük ve lab defteri ile kabul edilir.

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Mikrobiyoloji Tanı Laboratuvarında Serolojik Testler (immüno teknikler) 2015-2016, Bahar, Trakya Üniv Tıp Fak 6. Kurul, 14.03.2016 Neşe Akış, PhD, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı akisn@trakya.edu.tr http://personel.trakya.edu.tr/akisn

1 Laboratuvarlar

Üniversitemizde Tıp ile İlgili Laboratuvarlar Araştırma Lab: Tıp Fak., Ecz. Fak., Biyoloji Böl., Kimya Böl., Fizik Böl., Diş Hek. Fak., Bilgisayar Müh. Böl., Genetik ve Biyomüh. Böl., Gıda Müh. Böl., Elektrik-Elektronik Müh. Böl. Hastane Tanı Lab TÜTAGEM Kamu ve Araştırma Hizmet Laboratuvarı Eğitim Lab: Tıp Fak., Ecz. Fak., Biyoloji Böl., Kimya Böl., Fizik Böl., Diş Hek. Fak., Sağ.Bil.Fak., Bilgisayar Müh. Böl., Genetik ve Biyomüh. Böl., Gıda Müh. Böl., Elektrik-Elektronik Müh. Böl., 4 adet Bilgisayar Teknol.Bilişim Sist. Böl., Keşan Sağ.YO, Kırkpınar Bed.Eğ.Spor YO, 2 adet Elektr.Otomas. Böl., Kimya Kim.İşlt.Böl., Veterinerlik Böl., Hemşirelik ve Bakım Hiz. Böl., Sağ.Hiz.MYO

Hastanelerde Bulunabilecek Genel Tanı Laboratuvarları Islak Lab Kuru Lab Genel Hizmet: Merkez Lab (Biyokimya, Mikrobiyoloji, Patoloji, İmmünoloji, Hematoloji, Poliklinik Lab şubesi, Acil Lab şubesi) 2) Özel Lab (Genetik, Farma) Kliniğe Özgü Hizmet: Üroloji, Enfeksiyon, Adli Tıp, Onkoloji, Halk Sağlığı, Kan Banka, Transplantasyon Genel Hizmet: Radyoloji, Nükleer Tıp, Kliniğe Özgü Endoskopi Laboratuvarları, Acil Radyoloji şubesi Kliniğe Özgü Hizmet: Ekokardiyografi, Solunum, Ürodinami, Oftalmolojik Ölçüm, Odyometri, EKG, EMG, EEG, Anjiyografi, Uyku, Egzeris, Fiziksel Tıp, Psikiyatri

Tanı Laboratuvarı Personel Çeşidi Tıbbi uzman (lisans sonrası 3-4 yıllık alan eğitimi) Teknisyen laborant (lisans eğitim) Tekniker laborant (önlisans lab eğitim)

Laboratuvarın Hasta/Materyal Kabulü İstem kağıdında hastanın ön tanısı, varsa tanısı yazılı olmalı Materyalin uygun koşul ve şartlarda nakledilmesine ait bilgiler istem kağıdında yazılı olmalı (materyal saat kaçta alındı, nasıl muhafaza edildi, nasıl gönderildi) Biyogüvenlikle ilgili risk var mı istem kağıdına işlenmiş olmalı (hasta sifiliz, AIDS, EBOLA, vb..)

Islak Lab Hasta Materyal Çeşitleri Kan, serum, plazma Biyopsi örneği Deri veya tırnak kazıntısı, saç Mukozal sürüntü (boğaz, genital, üretral) İdrar, dışkı BAL İrin BOS

2 Seroloji

Seroloji Tanımı  Hasta materyalindeki antikorlar arasında belirli bir epitopa karşı gelişmiş olanlar aranmak isteniyorsa, özgün antijenine bağlanma reaksiyonu incelenerek belirleme yapılabilir. Bu tekniğe seroloji adı verilir.  Materyalde saptanan antikor miktarı antijen-antikor bağlanma reaksiyonunun şiddet düzeyi ile belirlenebilir.

Hasta materyalinde aranabilecek antikorlar Mikroplara karşı antikorlar Tümör antijenlerine karşı antikorlar Kan grubu antikorları Otoreaktif antikorlar Transplanta reaktif antikorlar Çevresel kimyasalların doku – hücre – plazma molekülleriyle birleşerek oluşturduğu yepyeni yapılara karşı antikorlar (besinler, ilaçlar, inhalanlar, vb…)

Vücutta antikor gelişmesi sebepleri 1- Bir antijen ne kadar kompleks yapıda ise immünojenite gücü (yanıt uyandırma kudreti, tehlikeli olma potansiyeli) o derece artar 2- Herhangi bir kimyasal hapten molekülüyle kompleks kurarak immünojenik yapı oluşturabilir

Antijen Serolojisi  Hasta materyalinde bir molekül veya antijenin varlığı aranmak isteniyorsa, özgün antikora bağlanma reaksiyonu incelenerek belirleme yapılabilir. Bu tekniğe antijen serolojisi adı verilir.

Hasta materyalinde aranabilecek moleküller Mikrop antijenleri Tümör antijenleri Yanlış katlanmış protein kümeleri (priyonlar, amiloid plaklar, vb..) Plazmada öz moleküller ve hormonlar Dokudaki, hücre yüzeyinde ve içindeki öz moleküller (MHC, vb..) İlaçlar, toksinler Alerjenler Çevresel kimyasalların doku – hücre – vücut molekülleriyle birleşerek oluşturduğu yepyeni yapılar

Mikrop Tanısında Seroloji 3 Mikrop Tanısında Seroloji

Mikrobiyolojik Tanı Laboratuvar Çeşitleri Bakteriyoloji Parazitoloji Seroloji Mikoloji Antibiyotik duyarlık TBC Moleküler

Seroloji Tekniğinde Prensip İçinde aradığın olan hasta materyalini al Aradığına bağlanan ligand (antijen/antikor) ile karıştır Aradığın varsa ligandı bağlanır Reaksiyonu görüntülenecek biçimde çoğalt Görüntü var mı? hayır evet Sonuç negatif Sonuç pozitif

Reaksiyon bir katı yüzeyine yapıştırılmış ligand ile yürüyor Reaksiyon sıvı içine eklenen ligand ile yürüyor

Presipitasyon Antikor ve antijen Hepsi birbirlerine çaprazlama bağlanınca ağırlaşarak çöküyor

Aglütinasyon Kürecik lateks ise lateks aglütinasyonu, eritrosit ise hemaglütinasyon Hepsi birbirlerine çaprazlama bağlanınca kümeleşerek çöküyor

Mikropları kullanarak antikor saptama

Lateks partiküllerini antijenle kaplayarak antikor saptama = Lateks aglütinasyonu

Eritrositleri antijenle kaplayarak antikor saptama = Hemaglütinasyon

Aglütinasyon testi, kullanılan test kabına göre de isimlendirilir Tüp Agg. Mikroplak Agg. Lam Agg. (çoklu çukurları olan mini tepsi)

Plak hemaglütinasyon testi Bakteri antijeni ile kaplı eritrosit üzerine hasta serumu eklenmiş Pozitif++ (serum 1/32) Pozitif++++ (serum ½) Pozitif+++ (serum 1/8) Negatif (serum 1/512) Pozitif+ (serum 1/128)

Heterofil Antikor Hasta serumunda antikor aramak için testte kullanılan antijen orijinal antijen değilse (taklidi, benzeri, suni, sentetik, vb. ise), test sonucu pozitif sonuç çıktığında heterofil antikor saptandı denir.

4 Kan Grubu Tayini

Kan grubu tayini Hasta eritrositleri üzerine kan grubu antikoru eklenir Bağlanma varsa eritrositler kümeleşir Lam agglütinasyon testi

5 Presipitasyon ve aglütinasyonda hepsi (tüm antijen ve antikorlar) birbirine nasıl çaprazlama bağlanır?

paratoplar epitoplar Antijen Presipitasyon ve aglütinasyon, 1 epitopa 1 paratop oranı sağlanırsa gerçekleşir

1 epitopa:1 paratop oranı tutturulamazsa çökme/kümeleşme görülmez HEPSİ BİRBİRİNE BAĞLANMIŞ 1 epitopa:1 paratop oranı tutturulamazsa çökme/kümeleşme görülmez

Valens Antijen üzerinde bulunan epitop sayısına o antijenin valensi dir. Antijen Antijen Az valensli antijen Çok valensli antijen

Antijen Antikor Serum seyreltmesi 1 epitopa 1 paratop oranı sağlamak için antikor (hasta serumu) seri seyreltilir

Serumun seri seyreltilmesi 2 ml 2 ml serum 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 Titre ünitesi: Çok kez seyreltildiği halde hala pozitif kalan serumda antikor yüksek titrededir

Bakteri molekülleri + hasta serumu = Ag:Ab oranı 1:1 ise PRESİPİTASYON Tüpte Plakta Jelde Çökelti gözle izlenebilir Bulanıklık nefelometre cihazı ile ölçülebilir Bulanıksızlık (geçirgenlik) turbitidometre cihazı ile ölçülebilir

6 Avidite

Avidite= paratop adedi X afinite 10-12

Aviditenin klinikte kullanımı Valensi belirli antijen pozitif hasta serumu ile ve ayrıca afinitesi belli paratopla paralel reaksiyona sokulur. Hasta serumunun bilinen paratopa göre kaç kat fazla reaksiyon verdiği ölçülerek aviditesi ortaya konur. Sadece aviditesi yüksek antikorlar IgM’dir, hastalık yeni başlamıştır (akut). Halbuki afinitesi yüksek antikor durumunda hasta bağışıktır veya latensi mevcuttur. Toksoplazma antikorlarının gebelikte aranmasında sık başvurulur.

Antikorun IgM ve IgG olmasının önemi Akut enfeksiyonda IgM antikoru vardır. IgM yüksek aviditesi nedeniyle hemen aglütinasyon verir. Enfeksiyon takip edildiğinde bir süre sonra IgM'ler IgG'ye dönüşür Bağışıklık veya latent enfeksiyonun nüks durumunda ise hastada özgül IgG antikorları vardır. IgG'nin yüksek titrede olması yakın zamandaki akut enfeksiyon veya nüks belirtisidir.

Coombs serumu etkisi ve 7 Coombs serumu etkisi ve pasif agglütinasyon

Görüntülenemeyen Agglütinasyon Düşük seviye ve IgG izotipinde antikor ile aglütinasyon kendiliğinden olmayabilir

Görüntülenemeyen Agglütinasyonun Pasif Agglütinasyonla görünür hale getirilmesi Coombs antikoru (anti insan-Fc antikoru) ile kümeleşmeye yardım edilebilir

IgG kümeleri IgM kümelerinden yavaş çöker Seruma ''Coombs serumu'' eklenirse IgG çökmesi hızlanır ve gözle görünür hale gelir

Laboratuvarlarımızdaki Aglütinasyon Testleri 8 Laboratuvarlarımızdaki Aglütinasyon Testleri

Mikrobiyal Seroloji Testleri Testin Adı Mikroorganizma Yöntem Rose-Bengal Brucella Lateks aglütinasyon Wright Tüp aglütinasyon RPR T.pallidum VDRL TPHA İndirek hemaglütinasyon Monospot test EBV Lateks aglütinasyonu Paul- Bunnel Direk hemaglütinason Soğuk Aglütinasyon Mycoplasma pneumonia Direk hemaglütinasyon Gruber- Widal deneyi Salmonella Tüp aglütinasyonu Weil- Felix Riketsiya Ekinokok İHA Echinococcus granulosus

Serolojide hata kaynakları 9 Serolojide hata kaynakları

Hata nedenleri Serumda fazla lektin varsa (sedimentasyon yüksek) bu küme oluşumunu engellerler. Hasta serumu seyreltilerek bu prozon etkisi bertaraf edilmelidir. Hastada antikor yetmezliği var ise özgül antikor aramak anlamsızdır. Bu nedenle serolojik antikor aranacaksa hastada antikor yetmezliği bulunmadığına emin olmak gerekir. Herpes simpleks virüsüne (HSV) karşı gelişen yanıt sınıfı genellikle IgM sınıfıdır. Bu nedenle IgM saptandığında bunun temasdan sonraki ilk 15 güne mi ait olduğu belirlenemeyebilir, çünkü kişi yıllardır bağışık olduğu halde hafızalı hücreler her temasdan sonra IgM izotipinde antikor üretir. Ayrıca, HSV ailesinin üyeleri ortak epitoplar taşıdıklarından birinde saptanan bir pozitiflik gerçekten o virüse mi özgü emin olmak gerekir veya sonuçların dikkatli yorumlanması gerekir

10 Katı faz serolojisi

KATI FAZ TEKNİĞİ Katı faz tekniklerinde antijen, katı absorban malzemenin yüzeyini kaplayacak biçimde zemine emdirilir. Antijenle kaplı zemin hasta serumuyla inkübe edilir. Serumda antikor varsa katı faza yapışır. Bağlanmayı görüntülemek için katı faza boya, radyoaktif atom veya renk sağlayıcı enzimle işaretlenmiş anti-insan antikoru eklenir.

Enzim Linkli İmmün Sorbeli Test (ELISA) Birbirlerine bağlanınca sıvı renkli boya ortaya çıkıyor Katı faz, plastik boncuk veya plastik mikroplak çukuriçi

İmmün Histokimyasal Test (IHA) Birbirlerine bağlanınca katı renkli boya ortaya çıkıyor Katı faz, kesit alınmış doku parçası

İmmün Floresans Test (IFA, floresans mikroskopi) Son ayıraç floresans boyalı, bağlanıyorsa orada bağlı kalıyor Katı faz, kesit alınmış doku parçası

Akan Hücre Ölçümü ile Antijen Ölçümü Katı faz lökositlerin kendisidir Anti-CD antikoru floresans boyalı Flow Cytometry Antikor lökosit yüzeyine bağlı kalıyorsa sonuç pozitif (hastada aranan CD’yi içeren lökosit var, örneğin CD4+ T gibi)

Rradyo İmmün Test (RIA) Son ayıraç radyoaktif, bağlanıyorsa orada bağlı kalıyor Katı faz, plastik boncuk veya plastik mikroplak çukuriçi

immün Elektron Mikroskopi (IEM) Antijen serolojisinde antikor altın metali bağlı, antijene bağlanıyorsa elektron geçirmiyor IEM Katı faz, kesit alınmış doku parçası

Katı faz tekniklerinde sonuç bir görüntüleme ile elde edilir Görüntü Sağlayan İşaretleyiciler: Enzimle renk gelişimi → ELISA Boya çökmesi → İmmün histokimya (IHA) Floresans veren boya → Floresans mikroskopi (IFA) ve akan hücre ölçer Metal atomu bağlama → IEM Radyoaktif ışıma veren atom → RIA

ELISA Dolaylı ELISA Doğrudan ELISA

RIA

Doku üzerinde IHA

IFA

Lenfositler içindeki CD4+ nüfusun ‘’floresan işaretli anti-CD4 antikoru’’ ve Akan Hücre Ölçer kullanılarak saptanması-1

Lenfositler içindeki CD4+ nüfusun ‘’floresan işaretli anti-CD4 antikoru’’ ve Akan Hücre Ölçer kullanılarak saptanması-2 Yan yansıtıcı= granülerite Ön yansıtıcı= büyüklük

Lenfositler içindeki CD4+ nüfusun ‘’floresan işaretli anti-CD4 antikoru’’ ve Akan Hücre Ölçer kullanılarak saptanması-3 CD4+ hücreler yeşil ışık alan PMT1’de ölçüldü CD4- hücreler kırmızı ışık alan PMT2’de ölçüldü Yan yansıtıcı= granülerite SONUÇ: 103- 101= 100 kat fazla Ön yansıtıcı= büyüklük