Clinica Chimica Acta 384 (2007) 28-34

... konulu sunumlar: "Clinica Chimica Acta 384 (2007) 28-34"— Sunum transkripti:

1 Clinica Chimica Acta 384 (2007) 28-34
İDRAR SEDİMENT İNCELEMESİ: OTOMATİZE İDRAR ANALİZ SİSTEMLERİ VE MANUEL MİKROSKOPİNİN KARŞILAŞTIRILMASI Tzu-I Chein, Jau-Tsuen Kao, Hui-Lan Liu, Po-Chang Lin, Jhih-Sian Hong, Han-Peng Hsieh, Miao-Ju Chien Çeviren Dr.Naciye KILIÇARSLAN ADÜTF BİYOKİMYA AD Ocak 2007

2 GİRİŞ İdrar analizi, klinik uygulamada, serum kimyası ve tam kan sayımından sonra kullanılan üçüncü majör testtir. Doğru bir idrar incelemesi sonucu, hastanın böbrek ve genitoüriner sistem durumunun ve diğer vücut sistemlerinin izlenmesinde direkt bir göstergedir. İdrar sedimentinin incelenmesi genellikle santrifüj edilmiş idrarda ve eğitimli teknisyenlerce yapılır.

3 Manuel analiz uygulamaları standardize edilmesine rağmen, idrar sedimentinin geleneksel mikroskopisi, yoğun çalışma gerektirir, zaman alıcıdır, kesin değildir ve geniş bir değişkenlik gösterir. İdrar analizinin otomasyonu ve santrifüj edilmemiş idrarın kullanımını kapsayan çalışmalar, manuel analizdeki değişkenlikleri azaltmıştır. Otomatize idrar analizi uygulaması, zaman ve iş gücü tasarrufu sağlar ve iş yoğunluğu fazla olan laboratuvarlar için daha uygundur.

4 Manuel mikroskopiyi otomatize etmek için halen, farklı teknolojileri kullanan iki sistem vardır. Biri, partikülleri saptamak ve ayırmak için önceden tanımlanmış partikül büyüklüğünü esas alan video kamera kullanan görüntü tabanlı analiz sistemidir. Diğer tip, flow sitometri prensibine dayanır. Her iki sistem, manuel mikroskopi ile karşılaştırıldığında artmış kesinlik ve modele sahiptirler.

5 Bu çalışmanın amacı idrar sediment testlerinde Sysmex UF-100 ve Iris iQ200 cihazlarının performansını değerlendirmek ve manuel mikroskopi ile karşılaştırmaktır.

6 MATERYALLER VE METODLAR
Örnekler ve yapılan işlemler Iris iQ200 Sysmex UF-100 Manuel mikroskopi Kesinlik testleri Sonuçların analizi

7 Örnekler ve yapılan işlemler
Sediment sonuçlarında geniş bir dağılımı sağlamak için, Ulusal Taiwan Üniversite Hastanesi laboratuvarına tanı amaçlı idrar analizi için gelen farklı anormallikleri kapsayan 436 hastanın taze toplanmış idrarları ile çalışıldı. İdrar toplamak için temiz saklama kapları kullanıldı. Her iki cihazla otomatize sediment testi yapıldıktan sonra, kalan idrar örneği 1500 rpm’de (400g) 5 dakika santrifüj edildi ve sediment, eğitimli teknisyenlere mikroskopi için gönderildi. Tüm örnekler, alındıktan sonra 2 saat içinde tamamen işlendi.

8 Iris iQ200 iQ200 cihazı 0.95 mL idrarı flow mikroskop içine alır. İdrar örneğindeki elementler, hidrodinamik sıvı zarfı odaklama suretiyle akım hücresinde bir düzlemde görüntülenir. Bir CCD dijital kamera örnek başına 500 fotoğraf çeker. Analiz işlemcisi, oto partikül tanıma (APR) yazılımı kullanarak partikülleri tanır ve sayar. Her görüntü büyüklüğüne, şekline, kontras ve doku özelliklerine göre otomatik olarak sınıflandırılır. Sonuçlar otomatik olarak 12 kategoride gösterilir ve eritrosit, lökosit, lökosit kümeleri, hiyalin silendirler, patolojik silendirler (veya sınıflandırılmayan silendirler), squamoz epitelial hücreler, nonsquamoz epitelial hücreler, bakteriler, mayalar, kristaller, mukus ve sperm konsantrasyonları kantitatif (nicel) olarak rapor edilir. Sonuçlar, son rapordan önce tekrar gözden geçirilebilir ve düzenlenebilir. Cihaz saatte 60 idrar analizi yapabilmektedir.

9 Sysmex UF-100 Örnekler iQ200 cihazı ile test edildikten sonra UF-100 cihazına manuel olarak transfer edildi. Raklar otomatik olarak proba doğru hareket eder ve orada bir pipet vasıtasıyla yaklaşık 0.8 mL idrar aspire edilir. Hücreler, bakteriler ve silendirler, volüme göre elektriksel özdirenç (empedans), büyüklüğe göre ileriye doğru ışık saçması, çekirdek ve sitoplazmik karakteristiklerine göre floresan boyanması vasıtasıyla ölçülür. Hücreler ve şekilli elementler, büyüklük, şekil, volüm ve boyanma karakteristikleri temelinde çok boyutlu alanda sınıflandırılır. Sonuçlar, ekranda saçılım grafilerinde gösterilir ve bir kopya sonuç elde edilebilir. İşleme kapasitesi saatte 100 örnektir.

10 Manuel mikroskopi 7 mL iyi karıştırılmış idrar santrifüj edildi. Supernatant (üst faz) döküldü, kalan 0.6 ml çökelti yeniden süspansiyon haline getirildi ve S-Y lamının karelerinden birine kapiller etki vasıtasıyla dolduruldu. Her lamda total 0.9 µL volüm için her biri 3x3x0.1 mm (0.9 mm3) derinlikte olan 10 büyük kare vardır. Hücresel bileşenler yerleşmeye bırakıldı ve ışık mikroskopisi ile incelendi. Bir mikroskopik alanda görülen hücreler veya partikülleri ilişkilendirebilmek için, bir ölçüm cetveliyle (scale) düşük güç alan (LPF) ve yüksek güç alan (HPF) bölgeleri belirlendi. Manuel mikroskopi sonuçları, 10/7 dilüsyon faktörü ile çarpıldı.

11 Kesinlik testleri Sonuçların tutarlılığını test etmek açısından, bir çalışmada çalışma içi (within-run) tekrarlanabilirlik için 3 idrar havuzu düzeyi 20 kere analiz edildi. Her ölçüm metodunun kesinliği, elde edilen yüzde varyasyon katsayısı (CV) vasıtasıyla incelendi. Çalışmalar arası (between-run) imprecision (kesin olmama) için, her yapımcı tarafından sağlanan, idrarda majör elementlerin büyüklüklerini taklit eden kalite kontrol örnekleri kullanıldı. Bu örnekler, çalışma süresince 20 ayrı günde analiz edildi ve her bileşen için CV’ler hesaplandı.

12 Sonuçların analizi Üç metodun karşılaştırılabilir elemanları, eritrosit, lökosit, epitelial hücre, bakteri, maya, kristal, sperm ve mukus sayılarını kapsar. Sayısal veri toplanması, çizelge haline getirilmesi, grafikler ve regresyon analizleri için Microsoft Excel elektronik çizelgesi kullanıldı. Yöntemler arası uyum, Bland ve Altman metodu vasıtasıyla incelendi. Metodlar arası farkın anlamlılığını test etmek için 2-kuyruklu Student t-testi kullanıldı. p<0.05 olması halinde sonuçlar anlamlı kabul edildi. Üç metoddaki bakteri, maya, kristal, sperm ve mukus sayılarının performansını karşılaştırmak için metodlar arası sınıflandırma sistemleri arasındaki farklılıklar veri analizinden önce aynı ölçeklere çevrildi. İdrar sediment sonuçları, 1 derece farkı içindeyse uyumlu kabul edildi ve 3 sistem arasında ikili gruplar halinde uyum oranı, en uygun çizgiden ±1 derece içindeki sonuçların yüzdesi olarak tanımlandı.

13 SONUÇLAR Otomatize cihazlar ve manuel mikroskopi kullanarak eritrositler, lökositler, epitelial hücreler ve bakterilerin tespiti için çalışma içi (within-run) tekrarlanabilirlik tablo 1’de gösterilmiştir.

14 Üç sistem küçük partikül sayılarında büyük CV’lere sahip olma eğiliminde olsa da genelde, manuel idrar analizi, otomatize sistemlerden daha yüksek çalışma içi CV göstermektedir.

15 2 otomatize cihaz ve manuel mikroskopi arasında majör elementler lökosit, eritrosit ve epitelial hücre sonuçlarının lineer regresyon çizgisi tablo 2’de listelenmiştir.

16 Metodlar arasında, epitelial hücre sayıları hariç 0. 935-0
Metodlar arasında, epitelial hücre sayıları hariç r değerlerine dayanan iyi bir uyum vardı. Epitelial hücreler için farklı sistemlerle ölçülen değerler zayıf olarak korele idi (r= ).

17 Tüm sistemlerin Bland-Altman grafikleri şekil 1-3’de gösterilmiştir.
Şekil 1. Lökosit sayıları için Bland-Altman grafikleri Şekil 2. Eritrosit sayıları için Bland-Altman grafikleri Şekil 3.Epitel sayıları için Bland-Altman grafikleri

18 Grafik, artan epitelial hücre sayılarıyla, iQ200 ve UF-100 için manuel metoddan daha yüksek sonuçlar eğilimi göstermektedir

19 İkili gruplar halinde 3 metodun bakteri, maya, kristal, sperm ve mukus sayıları için, farklı analitik sistemlerin uyumunu gösteren 1 derece içinde fark oranı tablo 3’de özetlenmiştir.

20 İdrarda kristal için, iQ200 ve manuel mikroskopi daha iyi uyum göstermiştir (%96.0).

21 3 metod arasında bakteri ve maya sonuçları tablo 4-5’de listelenmiştir
3 metod arasında bakteri ve maya sonuçları tablo 4-5’de listelenmiştir. Açık gölgelenmiş alan bir derece içindeki farklılıkları, koyu alan aynı derecedeki uyumlulukları gösterir. Tablo 4. Bakteri sonuçları Tablo 5. Maya sonuçları

22 Bakteri sayıları, 3 metod arasında büyük farklılık göstermektedir
Bakteri sayıları, 3 metod arasında büyük farklılık göstermektedir. iQ200’den oldukça çok örnek, ışık mikroskobu incelemesi vasıtasıyla bakteri pozitif bulundu. Diğer taraftan, manuel mikroskopi incelemesinden daha pozitif örnekler UF-100 vasıtasıyla bulundu.

23 Silendirler için UF-100’de 26 ve iQ200’de 15 örnek pozitif sonuç, fakat manuel mikroskopide negatif sonuç verdi. Karşıt olarak UF-100’de 6 ve iQ200’de 13 idrar örneği negatif, manuel mikroskopide pozitif sonuç verdi. Bu, UF-100’ün silendirler için, diğer 2 sistemden daha sık olarak pozitif sonuç verme eğilimini gösterir (veriler gösterilmemiştir).

24 TARTIŞMA Otomatize idrar analiz sistemleri, laboratuara yüksek işlem hacmi, çalışma ve bakımda en az tıbbi teknisyen gereğini sağlar. Bu sistemler, tamamen integre edilmiş kimyasal ve mikroskopik idrar analiz yeri sağlamak için, bir reagent strip kimya analizörüne bağlanabilirler. Bu çalışmada iki otomatize cihaz ve manuel mikroskopi performansları değerlendirilmiştir. Otomatize idrar analiz sistemlerin her ikisi, manuel mikroskopiden daha fazla kabul edilebilir kesinlik ve doğruluk göstermiştir.

25 Linko ve ark, iQ200 CV’sini gün içinde %4. 3 ve günler arasında %23
Linko ve ark, iQ200 CV’sini gün içinde %4.3 ve günler arasında %23.9; yüksek pozitif havuz ve düşük pozitif havuz için sırasıyla %6.93 ve %34.4 bildirmişlerdir. Aynı cihazlar için Lamchiagdhase ve ark, çalışmalar arası eritrosit CV’sini negatif kontrol için %61.6 ve pozitif kontrol için %6.4 olarak bildirmişlerdir. Ottiger ve Huber tarafından, UF-100’ün deney arası imprecisionu, CV’ler ile eritrosit için %4.8 ve lökosit için %2.1 olarak bildirilmiştir. Bununla birlikte Ben-Ezra ve ark, UF-100 cihazında, eritrosit için CV’yi çalışma içi % ve çalışmalar arası %2.7-6; lökosit için CV’yi çalışma içi % ve çalışmalar arası % bildirmişlerdir.

26 Bu çalışmadaki otomatize idrar analiz sistemlerinin imprecision verileri, diğer raporlarla benzerdir ve manuel mikroskopiden daha iyidir. Santrifugasyon ve volüm ölçümü gibi birçok faktör, manuel mikroskopinin imprecisionu ile ilişkili olabilir. Bakteri sayımı için manuel mikroskopide negatif, 1+, 2+, 3+, 4+ şeklinde sırasal (ordinal) sonuç ölçeği (scale) kullanıldı, bu yüzden CV’yi tanımlamak ve diğer iki otomatize cihazla elde edilen nicel (kantitatif) sonuçlarla karşılaştırma yapmak zor olmuştur.

27 Eritrosit ve lökosit sayımı için, UF-100 sistem ile manuel mikroskopi arasında korelasyon (karşılıklı ilişki) daha iyi idi. Ottiger ve Hubber UF100’ü KOVA sistem ile karşılaştırmıştır. Korelasyon katsayıları eritrosit için ve lökosit için idi. iQ200 ile görsel (visuel) mikroskopi arasında eritrosit ve lökosit sayıları için iyi korelasyonlar vardı. Linko ve ark, eritrosit, lökosit ve epitelial hücreler bulunmasında manuel mikroskopi ile iQ200’ü karşılaştırdılar. Korelasyon sonuçları, eritrositler için 0.948, lökositler için ve epitelial hücreler için idi.

28 Bu çalışmada 2 otomatize sistem ve manuel mikroskopi arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık bulunmamasına rağmen, Bland-Altman grafiklerden (şekil 1 ve 2) görülebileceği gibi, UF-100 sistem vasıtasıyla eritrositler ve lökositler hafifçe daha fazla ölçüldü. Şekil 1. Lökosit sayıları için Bland-Altman grafikleri Şekil 2. Eritrosit sayıları için Bland-Altman grafikleri

29 Daha yüksek eritrosit ve lökosit seviyelerinde, iQ200 sistem ile elde edilen eritrosit ve lökositler manuel mikroskopiden daha çok olma eğilimindedirler (şekil 1 ve 2). Benzer bulgular rapor edilmiştir. Şekil 1. Lökosit sayıları için Bland-Altman grafikleri Şekil 2. Eritrosit sayıları için Bland-Altman grafikleri

30 Bu hücresel bileşenler için UF-100 ve manuel metodlar arasında iyi uyuma karşın UF-100 cihazı, daha fazla eritrosit, lökosit ve epitelial hücre bulmuştur. Bu olasılıkla santrifüjün yetersiz olması veya manuel saymada hatalar yüzündendir, çünkü iki otomatize sistem arasında iyi uyum vardır ve aralarında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmamıştır. Şekil 1. Lökosit sayıları için Bland-Altman grafikleri Şekil 2. Eritrosit sayıları için Bland-Altman grafikleri

31 Ottiger ve Hubber, çalışılan örneklerin %12’sinde eritrosit ve bazı örneklerde hem eritrosit hem lökositlerin UF-100 ile yanlış sınıflandırıldığını ve bunun da yanlış sonuçlarda artışa sebep olduğunu rapor etmişlerdir. Langlois ve ark, UF-100’ün eritrositi daha fazla saymasının ya kristal ya maya hücre sayısı yüksekliğine bağlı olduğuna dikkat çekmişlerdir. Wah ve ark, eritrosit, lökosit ve epitelial hücreler için, iQ200 sistem ve Fuchs-Rosenthal sayma odaları kullanarak manuel hücre sayımı arasında iyi korelasyon olduğunu, bununla birlikte iQ200’ün manuel metodlara göre daha az hücre tanımladığını rapor etmişlerdir.

32 Eritrosit ve lökosit sayıları açısından UF-100 ile iQ200 sistemleri arasında daha iyi korelasyon gözlenmekle birlikte, iQ200 sistem ile manuel mikroskopi arasında epitelial hücreler için daha iyi korelasyon bulunmuştur. İki otomatize sistem arasında epitelial hücreler için korelasyon katsayısı gözlendi; aynı zamanda iki otomatize sistem arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark vardı (p=0.01).

33 UF-100 sistem, şekil 3’teki Bland-Altman grafiğinden görülebileceği gibi, manuel mikroskopiye oranla daha fazla epitel hücresi tanımlamıştır. Manuel metoda, santrifügasyon, üstteki sulu kısmı çökeltiden ayırma ve çökeltiyi tekrar suspansiyonlaştırma adımları ya yetersizdir ya da hücrelerin kaybına ve parçalanmasına yol açmıştır.

34 Ben-Ezra ve ark, proteinin, yanlış olarak yüksek epitelial hücre sayısı sonucunu veren lökosit kümeleri için en olası neden olduğunu belirtmişlerdir. 3 sistem arasında düşük korelasyona neden olan bir başka olasılık, idrarda düşük epitelial hücre sayısıdır. Epitelial hücre sayısı daha yüksek değerde idrar örnekleri kullanılırsa korelasyon düzelebilir. Bakteri sayıları üç metod arasında büyük farklılık göstermiştir. UF-100 ve manuel mikroskopik inceleme, diğerlerinden daha iyi korelasyon göstermiştir (%92). Parlak ışık mikroskopisi ile incelemede, iQ200 ve UF-100 sistem ile olandan daha çok örnek bakteri pozitif bulundu.

35 Toffaletti ve ark, bakterilerin 2 floresan boya ile boyandığı ve flow sitometri vasıtasıyla analiz edildiği IRIS900UDx ile UF-100 karşılaştırıldığında bakteri sayısı açısından büyük oranda farklılıklar olduğunu göstermişlerdir. Tıbbi teknisyenler tarafından, otomatize iQ200’ün basiller dışında küçük kok görüntülerini bakteri olarak yorumlamak zordur. Hem Lamchiagdhase ve ark hem Alves ve ark, bakteri varlığında manuel mikroskopi ile doğrulama gerektiğini ileri sürmüşlerdir.

36 Maya hücreleri için iQ200 sonuçları, daha yüksek yalancı pozitif sayısı göstermiştir. Benzer sonuçlar bildirilmiştir. iQ200’in diğer şekilli elemanları maya hücreleri olarak saptadığı açıktır. Bu nedenle son rapor onaylanmadan önce bellek görüntülerini incelemek veya manuel mikroskopi vasıtasıyla sonuçları doğrulamak gereklidir. Longlois ve ark, UF-100’ün maya hücresi sayısında daha fazla farklılık gösterdiğini ve sıklıkla yalancı pozitif olduğunu rapor etmişlerdir. Onlar, pozitif UF-100 maya hücrelerinin daima mikroskopik inceleme gerektirdiğini ileri sürdüler.

37 Bu çalışmada iQ200’de yanlış rapor edilen maya veya kristaller çok sık olmasına rağmen, bu partiküller esas partikülerin analizinde anahtar eleman değillerdir ve rutin iQ200 raporlarında uygun eşikleri ayarlama suretiyle bertaraf edilebilir. Bazı idrar örneklerinin soğutulmasını takiben ara sıra üre veya fosfat kristalleri gözlenebilecektir. Silendirler, iki otomatize sistem vasıtasıyla zor ayırt edilmektedir. Bu tüm otomatize idrar analizörlerinin kısıtlamasıdır. Yine de UF-100, silendir, kristal ve bakteri varlığında teknisyenlere onların varlığını ve mikroskopi altında daha ileri karakterize etmek gerektiğini işaret eder. Tekrar gözden geçirme oranı %26.7’dir (veriler gösterilmemiştir).

38 Trichomonas, UF-100 cihazı ile tanımlanamamaktadır
Trichomonas, UF-100 cihazı ile tanımlanamamaktadır. Longlies ve ark, yanlış pozitif UF-100 silendirli bazı örneklerde Trichomonas bulunduğunu, bunların ekranda tekrar gözden geçirme işaretlerine neden olduğunu ve bu örneklerin mikroskopik inceleme suretiyle tanımlanabileceğini rapor etmişlerdir. Lamchiogdhase ve ark, iQ200 sistem vasıtasıyla, Trichomonas türlerinin ilk olarak nonsquamoz epitelial hücreler olarak bildirildiğini rapor etmişlerdir. Bazen Trichomonaslar iQ200’de CDD dijital kamera ile bir görüntü olarak belirmekle birlikte hareket kaybı nedeni ile tanımlanmaları zordur.

39 İki otomatize idrar sediment analizöründe bazı sınırlamalar olmasına rağmen kısıtlamayı azaltma, otomatize sonuçları eritrosite karşı gizli kan, lökosite karşı lökosit esteraz, silendire karşı protein ve bakteriye karşı nitrit gibi stript verileri ile çapraz karşılaştırma suretiyle başarılabilir.

40 Özet olarak; iki otomatize idrar analiz sistemi, idrar sediment incelemesinde birbiriyle iyi korelasyon göstermiştir. Bu yüzden, idrarın kimyasal analizi ile birleştirildiğinde bu analizörler, rutin idrar analizlerinde hızlı ve doğru tarama aracı sağlayabilirler. İdrar sediment incelemesinin otomasyonu; farklı personelden kaynaklanan farkı azaltabilir, manuel gözden geçirme oranını azaltır ve manuel mikroskopiye benzer sonuçlar verir.

41 TEŞEKKÜRLER