Mutasyon Analiz Teknikleri I

... konulu sunumlar: "Mutasyon Analiz Teknikleri I"— Sunum transkripti:

1 Mutasyon Analiz Teknikleri I
Hafta VII PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları Mutasyon Analiz Teknikleri I Prof. Dr. Hilâl Özdağ

2 DHPLC Transgenomic/WAVE

3 DHPLC http://insertion.stanford.edu/melt.html
BRCA ex1 CAATAGGTAGCGATTCTGACCTTCGTACAGCAATTACTGTGATGCAATAA GCCGCAACTGGAAGAGTAGAGGCTAGAGGGCAGGCACTTTATGGCAAACT CAGGTAGAATTCTTCCTCTTCCGTCTCTTTCCTTTTACGTCATCCGGGGG CAGACTGGGTGGCCAATCCAGAGCCCCGAGAGACGCTTGGCTCTTTCTGT CCCTCCCATCCTCTGATTGTACCTTGATTTCGTATTCTGAGAGGCTGCTG CTTAGCGGTAGCCCCTTGGTTTCCGTGGCAACGGAAAAGCGCGGGAATTA CAGATAAATTAAAACTGCGACTGCGCGGCGTGAGCTCGCTGAGACTTCCT GGACGGGGGACAGGCTGTGGGGTTTCTCAGATAACTGGGCCCCTGCGCTC AGGAGGCCTTCACCCTCTGCTCTGGGTAAAGGTAGTAGAGTCCCGGGAAA GGGACAGGGGGCCCAAGTGATGCTCTGGGGTACTGGCGTGGGAGAGTGGA TTTCCGAAGCTGACAGATGGGTATTCTTTGACGGGGGGTAGGGGCGGAAC CTGAGAGGCGTAAGGCGTTGTGAACCCTGGGGAGGGGGGCAGTTTGTAGG TCGCGAGGGAAGCGCTGAGGATCAGGAAGGGGGCACTGAGTGTCCGTGGG GGAATCCTCGTGATAGGAACTGGAATATGCCTTGAGGGGGACACTATGTC TTTAAAAACGTCGGCTGGTCATGAGGTCAGGAGTTCCAGACCAGCCTGAC CAACGTGGTGAAACTCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGCG TGGTGCCGCTCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGCTAGAAC C with 851 base pairs Melting temperature of entire strand: 61.25° Temperature = 55° Celsius: 1-3, Temperature = 56° Celsius: 4-5, Temperature = 57° Celsius: , Temperature = 58° Celsius: 6-6, , , Temperature = 59° Celsius: 7-48, , , , Temperature = 60° Celsius: , , , , Temperature = 61° Celsius: , , , Temperature = 62° Celsius: , This sequence should be run at all of the following temperatures to ensure detection of all polymorphisms. Recommended temperature: 62° Recommended temperature: 56°

4 DHPLC CBP Exon 6 A. Rothan’dan

5 DHPLC A. Rothan’dan

6 DHPLC A. Rothan’dan

7 DHPLC Ezzeldin et al. Ann Biochem. 2002;306:63-73.

8 DHPLC

9 DHPLC DHPLC = denaturing high-performance liquid chromatography.
Ezzeldin et al. Ann Biochem. 2002;306:63-73.

10 Karıştırma testi DHPLC
P300/EXON16 4239G->T E1014X

11 Karıştırma testi DHPLC
CBP/EXON31.1 5371-8INSA

12 DHPLC HDAC2 EXON1 Karıştırma

13 HDAC2 143InsCAG

14 DHPLC HDAC2 EXON12 Karıştırma

15 HDAC2 1573DelA HCT15

16 HSUV39H2 -11InsA (?) SSCP

17 Kapiller Elektroforez

18 Genel Primerlerle işaretleme

19 P G>T (E1014X)

20 P G>T (E1014X )

21 CBP IVS21-4del22

22 CBP IVS21-4del22

23 CBP IVS31-7InsA

24 CBP IVS31-7InsA

25 TGCE Temperature Gradient Capillary Electrophoresis

26 Mutasyon Analiz Teknikleri III
Hafta IX PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları Mutasyon Analiz Teknikleri III Prof. Dr. Hilâl Özdağ

27 Bir sonraki aşama…. 1. SSCP, HA, DHPLC, TGCE benzeri bir teknikle saptadığınız ve incelediğiniz DNA fragmentinde konformasyonel değişime neden olan dizi değişiminin ne olduğunu ortaya çıkarmak, 2. İncelediğiniz DNA fragmentini bir indirekt yöntemle analiz etmeden doğrudan dizi bazında değerlendirmek, 3. Klonlamak üzere hazırladığınız DNA fragmentine klonlama öncesi aşamalarda (PCR) hatalı bir baz girip girmediğinden emin olmak için Bir sonraki aşama DNA dizi analizidir.

28 DNA DİZİ ANALİZİ

29 PCR TEMELLİ MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİ
MUTASYONU ÖNCEDEN BİLİYOR VE YENİ BİR ÖRNEK GRUBUNDA VARLIĞINI SORGULAMAK İSTİYORSANIZ RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism) ASA (Allele Specific Amplification) Primer Extension

30 PCR TEMELLİ MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİ
RFLP Yabanıl Tip Allel AGATCT TCTAGA RE kesim bölgesi Mutant allel AGAGCT TCTCGA RE bölgesi kaybolmuş

31 PCR TEMELLİ MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİ
ASA

32 Primere bir nt eklenmesi
Primer Extension : Saptama: Floresans Bağlanma: Primere bir nt eklenmesi Uzama:

33 Primer Extension :