ANALİTİK YÖNTEM VALİDASYONU Yrd.Doç.Dr. Aysel KÜÇÜK TUNCA

YÖNTEM: Spesifik bir analitin analizi için uygulanan bir işlem ya da işlemler topluluğuna yöntem denir.

Yöntem Geçerliliği (Validasyon) Nedir? Neden önemlidir? Neden gereklidir? Ne zaman yapılmalıdır? Nasıl yapılmalıdır? Nerede yapılmalıdır? Kim yapmalıdır?

Yöntem geçerlilik testi (validasyon) nedir? Validasyon, niyet edilmiş herhangi bir analitiksel yöntemin uygun olup olmadığını görmek için uygulanan test etme yoludur. Yöntem geçerlilik testlerinin (validasyonun) amacı, elde edilen sonuçların doğru olduğunu desteklemek ve kullanılan şartlar altında uygulanan işlemlerin açıkça yapılabilirliğini göstermektir.

Yöntem geçerlilik testi (validasyon) niye yapılmalıdır? Analitik Yöntem Geçerlilik İşlemleri (Validasyon) bir analiz için belirlenen yöntemin niyet edilen amaç için uygun ve tekrarlanabilir olup olmadığını görmek ve özellikle analitik yöntemi test etmek için yapılır. Dolayısıyla analiz sonuçlarıyla ilgili özgüven kazanılmasını da sağlar.

Validasyon (geçerleme), bir sistemin, cihazın yada yöntemin belirlenen koşullara ve amaca uygun olduğunu göstermek için yapılan işlemlerin bütünüdür. Uygulamadan emin olmak için, cihaz veya analitik yöntemin düzgünlüğünü, doğruluğunu ve kesinliğini tasarlamak için validasyon işlemi yapılmalıdır. Validasyon, aynı zamanda bir ürünün veya analitik yöntemin, arzu edilen ürüne veya yönteme uygun sonuç alma süreci ya da ürünleri değerlendirme prosesi veya ürünleri garantiye almak için analitik yöntem veya yöntem gereksinimi olarak da tanımlanmaktadır.

Yeni bir laboratuar kurmak zor değildir Yeni bir laboratuar kurmak zor değildir. Yeni aygıtlar, malzemeler, kimyasallar alırız. Yöntemler zaten standart olarak verilmektedir. Ama burada çok ince bir ayrıntı asla gözden kaçırılmamalıdır. Bir laboratuarın değeri malzemelerinin, aygıtlarının yeniliği ya da çağdaşlığı ile değil, yaptığı analizlerin doğruluğu ile ölçülür. İşin ilginç yanı, doğru analiz yapmak gerçekten zor bir işlemdir. Analizlerde belirsizlik denilen kavram işte bu zorluktan doğmaktadır.

Bundan daha da öncelikli olan konu da, bir analiz yönteminin bizim laboratuarımıza uygunluğunun araştırılmasıdır. Çünkü her yöntem, kendi özel koşullarında uygulama alanı bulabilir. Bu koşullardaki en küçük bir değişiklik, yöntemin belirsizliğini artırır. Kısaca, bir analizi doğru olarak yapabilmek için, laboratuarımızı o analize uygun hale getirmeliyiz. İşte bunun sağlanması için de uygulanan işlem yöntem geçerliliğidir. Ya da tam tersine, bir analiz yönteminin var olan laboratuara uygunluğu da yine geçerlilik (validasyon) kavramı ile ifade edilir.

Laboratuarı etkileyen en küçük bir değişikliğin, analiz yöntemlerinde ciddi bir geçerlilik tartışması başlatacağı açıktır. Yeni bir aygıtın satın alınması, laboratuarın yerinin değiştirilmesi, yeni bir bölüm eklenmesi gibi olaylar da bizi hep bu denetime götürür. Hatta yapılan bir analizin, başka bir laboratuarda farklı sonuç vermesi de, öncelikle kendi laboratuarımızda bir yöntem geçerliliği denetimini yapmayı yine zorunlu kılar.

Laboratuar çalışmalarımızın doğruluğundan emin olabilmemiz için öncelikle donanımımızın tam istenilen düzeyde olduğunu garanti etmemiz gerekir. Bunun için tüm aygıtların ayar ve bakımları sık aralıklarla yapılmalı ve mutlaka kayıt altına alınmalıdır. Bu kayıtların kalite kontrol grafikleri halinde incelenmesi de, bize alt ve üst ölçüm düzeylerini verecektir. Yöntem geçerliliğini denetlemek planlı bir çalışmadır. Önceden hazırlanan denetim planı titizlikle uygulanmalı, her seferinde aynı yolu izlenmeye özen gösterilmelidir. Daha sonra deney uygulaması başlar. Elbette bir deneyin başlangıcı; her zaman örnek alma ve hazırlama tekniğidir. Çünkü uygun olmayan bir örneğin uygun sonuç vermesi beklenemez.

Öncelikle kullanılan herhangi bir yöntemin rutin kullanımına geçmeden önce, valide edilmiş bir yöntemde değişiklik yapılacaksa veya orijinal yöntemin dışına çıkılıp değişiklikler yapılacaksa da, mutlaka yöntem validasyonu yapılması gerekmektedir.

Yeni bir yöntemin rutin kullanımına geçmeden önce, mutlaka yapılması gereken validasyon çalışmaları şu durumlarda tekrarlanmalıdır: Yeni cihazlar devreye girdiğinde, Temel kimyasallardaki partilerde önemli bir değişiklik olduğunda, Yeni personel tarafından yöntem ilk kez kullanıldığında, Uzun süredir kullanılmamış ve valide edilmiş bir yöntemin yeniden kullanıma alınması durumunda, Laboratuarda yapılan ve sonuçları etkileyebileceği düşünülen çeşitli değişikliklerde.

Validasyon (geçerleme), aynı zamanda yapılan analizin istenen bilgiyi elde etmeye elverişli olup olmadığını da belirleme işlemidir. Bu işlem, numunelere, izlenen usule ve verilere uygulanabilir. Numunelerin validasyonu, çoğu zaman, numunelerin ait olduğu popülasyonu temsil edip etmediğini tetkik için; numuneleri ölçmeye kabul için; numunelerin orijinal olup olmadığına bakmak için ve gerekiyorsa; yeniden numune almaya karar vermek için yapılır. Validasyon işlemi sırasında, numunelerin kimliği ve muhafaza şekli ile ilgili şüpheler varsa veya numunelerin alınıp toplanması sürecinin geçersiz yada şüpheli olduğu biliniyorsa, numuneler reddedilebilir. Örneğin, bir suçun aydınlatılmasında delil için adli tıp kurumlarına gelmiş kan numunelerinin, kan alma sırasında kirlenmesi, bu numunelerin reddi için bir sebeptir.

Laboratuarlar ve analizciler kullandıkları yöntem ve tekniklerin geçerliliğini periyodik olarak ve sık sık kontrol etmelidir. Verilerin validasyonu, sonuçları rapor etme öncesi yapılan son geçerleme işlemidir. Bu yüzden, işlem öncesinde numunelerin ve yöntemlerin geçerliliği muhakkak sorgulanmış olmalıdır. Numune alma ve işlemede, analiz sırasında, numune etiketlemede ve hesaplamalarda yapılmış olası hatalar iyice gözden geçirilip giderildikten sonra, veriler, istatistik bakımdan geçerli sınırlar arasında kalacak şekilde rapor edilmelidir.

YÖNTEM GELİŞTİRME VE VALİDASYONDA EN ÇOK KULLANILAN YÖNTEMLER Bu yöntemler ihtiyaçları büyük oranda karşılayan yöntemler olmalıdır: Kromatografik Yöntemler Spektroskopik Yöntemler Kapiler Elektroforez Yöntemler Dissolüsyon Yöntemler Titrasyon Yöntemleri Elektro Analitik Yöntemler

Güvenilir Ticari bir kurumdan elde edilen Referans maddeler, YÖNTEM GELİŞTİRME VE VALİDASYON İŞLEMLERİNDE KULLANILAN REFERANS MADDELER Güvenilir Ticari bir kurumdan elde edilen Referans maddeler, Onaylanmış Referans Maddeler (NIST, ISO/ICE, IUPAC), Güvenilir bir laboratuar tarafından belirlenmiş saflıkta sentezlenmiş referans maddeler olmalıdır.

Deneyimizin kimyasal yapısı çok iyi bilinmeli, analizin yalnızca aranan maddeyi bulmaya yönelik olduğu düşüncesiyle, ortamdaki diğer maddelerin etkileri önceden saptanmalıdır. Çünkü günümüzdeki kirletici kimyasalların etkileri sanıldığından çok daha yaygın durumdadır. Deneyde daha önce hiç karşılaşmadığınız sonuçlarla karşılaşabilir ve geçerlilik denetimi yapmak zorunda kalabiliriz. Denetimler sırasında böylesi etkileri de göz önünde bulundurmalıyız.

Deney yaparken, örnek almadaki temel kuralımız; her zaman aynı biçimde örnek alınması ve uygulanan teknikte değişiklik yapılmamasıdır. Söz gelimi tankerlerden örnek alırken kimi yerlerde dalgıç şişe, kimi yerlerde cam tüp kullanılması sonuçları ciddi biçimde etkiler. Yığın halindeki bir maddeden onu doğru temsil eder nitelikte, miktarı az bir örnek madde alma işlemidir. Örnekleme tekniği olabilecek en uygun biçimde yapılmalı ve uygunluk ilgili tüm taraflarca onaylanmış olmalıdır. Örneği analize hazırlamada da değişmez uygulamalar ortaya konmalıdır. Analize hazırladığınız örneği canınız istediğinde filtreden geçirip, aceleniz olduğunda çalkalamakla yetinemezsiniz.

Öte yandan işin en can alıcı noktası, analiz sırasında yapılan işlemlerin tam olarak kayıt altına alınmasıdır. Hatta örnek kaplarının hazırlanmasından başlayarak yapılan tüm işlemlerin bir kaydı olmalıdır. Bu şekilde örnek almadan başlayarak tüm analiz boyunca oluşan olayları inceleyebilir ve sonuçlar çıkarabiliriz. Bunun adına da izlenebilirlik denir. Yalnızca örnek alma ve hazırlama değil, analizin tüm aşamaları daha sonra izlenebilir durumda bulunmalıdır.

Yeni bir yöntemin rutin kullanımına geçmeden önce, mutlaka validasyon çalışması yapılması gerekli olduğunu ve çeşitli durumlarda da tekrarlanması gerektiğini artık biliyoruz. Analitik yöntemlerin geçerli olabilmesi için gereken geçerlilik parametrelerinin (doğruluk, kesinlik v.s.) de incelenmesi gerekmektedir. Deneysel olarak elde edilen veriler değerlendirilmeli ve daha sonra validasyon ve istatistik açısından deney sonuçları yorumlanmalıdır.

Spesifik bir analitik yöntemin geliştirilmesi, geçerlilik işlemlerinin yapılması ve rutin numune analizlerinde bu yöntemin kullanılmasındaki işlemler üç basamağa ayrılabilir. Bunlar: (1) standart maddeden numune hazırlanması, yöntemin geliştirilmesi ve çalışma parametrelerinin belirlenmesi, (2) yöntem geçerlilik testlerinin yapılması ve çalışmanın sürekli kullanılabilir hale getirilmesi, (3) ve rutin analizlere bu yöntemin tatbik edilmesi.

YÖNTEM GELİŞTİRME BASAMAKLARI: Yöntemin amacı, kapsamı ve uygulaması tanımlanır. Performans parametreleri ve kabul kriterleri tanımlanır. Cihazın performans karakterleri tanımlanır. Yöntem için materyaller nitelenir. Yöntem geliştirilir ve optimize edilir. Yöntem belgelenir. Geliştirilen yöntemin validasyonu yapılır.

Kurallar Analitik alanda farklı amaçlara göre düzenlenen kurallar dünyanın farklı bölgeleri ve farklı amaçlara göre farklılıklar göstermektedir. Yöntem validasyonu için kurallar oluşturan grupların bazıları ise aşağıda verilmiştir: ISO/IEC Guide 25 ICH U.S. EPA U.S. FDA USP cGMP ICH (The International Conference on Harmonization) İnsan üzerinde kullanılan Farmasötik Ürünlerin ruhsatlandırılmasındaki teknik gereksinimlerin harmonizasyonu için yapılmış uluslararası bir konferanstır.

FARMAKOPE: İlaç üretiminde kullanılan etkin ve yardımcı maddelerin nitel ve nicel çözümleme yöntemlerinin yer aldığı yasal ve bilimsel olarak uyulması gereken ulusal ve uluslararası kuralları ve yöntemleri içeren resmî bir kitaptır. İlaç analizinde bakılacak yerler; FDA USP ICH DMF EP/BP Diğer farmakopeler

Yöntem Geçerlilik Testi (Validasyon) Valide edilmesi gereken nedir? Analitik sonuçlar üzerinde etkisi olan tüm bileşenler! Cihaz + Hardware ve Software Analitik yöntem Sistem Uyumluluğu Cihaz Niteliği Yöntem Validasyonu Rutin Kontrol

Yöntem için Önemli Parametreler Nelerdir? Soruları cevaplamak için, aşağıda verilen tanımlar kullanılır: Doğru bileşik ve/veya bileşiklerin ölçümü yapıldığından emin miyiz? (Specificity/Selectivity; Özgünlük/Seçicilik) Sonuçlar ne kadar doğru olmalıdır? (Accuracy; doğruluk) Belirlenen sınırlar içinde miktar tayininin yapılabileceğinden emin miyiz? (Linearity ; doğrusallık) Teşhis için en düşük derişim nedir? (Limit of Detection; teşhis limiti) Doğru miktar tayini için limit nedir – alt ve üst sınır (Limit of Quantitation and Working Range; Miktar tayin limiti ve Çalışma aralığı) Yöntemin değişik laboratuvarlarda uygulanması sonucu kesin sonuçlar alınabiliyor mu? (Reproducibility; Yeniden üretebilirlik) Analizin yapıldığı laboratuvarda kesin sonuçlar her zaman alınabiliyor mu? (Repeatability; Tekrarlanabilirlik) Değişik cihaz ve operatör kullanıldığında kesin sonuçlar alınabiliyor mu? (Intermediate Precision; Kesinlik )

Geçerlilik testlerindeki (Validasyon) adımlar nelerdir? Değerlendirme Plan Ölçme

VALİDASYON NE ZAMAN YAPILIR? Metot laboratuarda ilk defa uygulanacağı zaman, Yeni bir metot geliştirildiği zaman, Mevcut metotta değişiklik yapıldığı zaman, Geçerli kılınmış bir metot farklı bir laboratuarda, farklı bir cihazla veya farklı bir analist tarafından kullanıldığında, Kalite kontrol sırasında mevcut metodun zamanla değiştiği anlaşıldığında, İki metodun eşitliğinin karşılaştırılması gerektiğinde yapılır.

Ölçüm Metotları Standart metotlar –ISO, ASTM vs. Modifiye standart metotlar Yayınlanmış metotlar Laboratuarda geliştirilmiş metotlar

Sonuç olarak, laboratuarda yapılan analizler ilk bakışta son derece basit yöntemlere dayanmaktadır. Ama yukarıda da gördüğünüz gibi, doğru sonuca ulaşmak ve analizi doğru yapmak sanıldığından çok daha ayrıntılı bir çalışmadır. Üstelik elde ettiğiniz düzeyi korumak ve sürdürmek de çok daha ayrıntılı ve yoğun bir güç harcanmasını gerektirir. Yani kısaca, analiz raporuna doğru sonuçları yazmak sanıldığı kadar basit bir iş değildir!