BİO 304 Moleküler Genetik Dr. Hatice Mergen

Genetik Materyalin Özellikleri Replikasyon Bilgi depolama Depolanmış bilgiyi ifade etme Mutasyonlar ile varyasyon sağlama

Genetik Materyal hangi moleküldür?-Protein mi? DNA mı? 1. Hücrelerin kuru ağırlığının % 50’sini proteinler oluşturur. 2. Tetranükleotid hipotezi : 1900’lerin başından ortalarına kadar kabul edilmiş bir hipotezdir. *1868-Friedrick Miescher, hücrelerin stoplazmasından çekirdeklerini ayırmış ve bunlardan “nüklein” olarak adlandırdığı asidik bir madde elde etmiştir. Nüklein çok miktarda fosfor içerirken hiç protein yapısında yer alan kükürdü hiç içermez. (Phoebus Levine, 1910) 4 nükleotid tekrarı 1:1:1:1 oranı, tek kovalent bağla bağlı tekrarlar basit olduğundan varyasyon için uygun değildi Proteinler 20 aa içeriyordu ve farklılık için uygundu Sonuç olarak bu spekülasyon için protein görüşü ağır basmıştır ancak 3. 1940’lardan önce çoğu genetikçi aktarım genetiği ve mutasyon çalışmaları ile uğraşmıştır. Bu nedenle genetik materyal nedir kaygısı geri plana itilmiştir. 1910-1930 tetranükleotid hipotezi geçerli 1940- Chargaff’s Rules- birçok organizma için 1:1:1:1 oranı doğru değildir.

Genetik Materyal DNA’dır Frederick Griffith- 1927 yılında İngiliz Sağlık Bakanlığı memuru iken Diplococcus pneumoniae ile yaptığı transformasyon deneylerinde ilk kanıtları ortaya koymuştur. Avery, MacLeod, ve McCarty (1944)-”transformasyon prensibi”nin kimyasal doğası ile ilgili makaleleri DNA’nın genetik materyal olarak kabul edilmesinde ilk adım olmuştur. Hershey ve Chase (1952)-bakteriyofaj T2 deneylerinde DNA’nın genetik materyal olduğunu ikinci kez ispatlamıştır.

Frederick Griffith’s Transformation Experiment - 1928 Diplococcus pneumoniae- insan ve sıçanda zatürre etkeni Virülant (hastalık oluşturma etkeni)- polisakkarit kapsül yapısı içerir.Fagosirtik hücrelerce kolay parçalanmaz. Agar kültüründe parlak, düz (smooth:S) koloniler oluşturur. Avirülant -Kapsülsüz, hayvanın dolaşım sisteminde fagositik hücreler tarafından hızla alınıp parçalanır. Pürüzlü (rough:R) koloniler oluşturur. Her bir diplococcus suşu serotip olarak adlandırılır. Serotipin özelliği kalın, ypışkan kapsüldeki polisakkarit içeriğinin ayrıntılı kimyasal yapısından kaynaklanır. İmmunolojik teknikler ile tanımlanırlar ve romen rakamı ile gösterilirler. Tip I ve II Amerikadaki en yaygın zatürre etkeni Griffith Tip II ve III’ü kullanmıştır.

Fig. 2.2: Frederick Griffith’s Transformation Experiment - 1928 “transforming principle” demonstrated with Streptococcus pneumoniae Griffith hypothesized that the transforming agent was a “IIIS” protein.

Ölü sıçanların kanındaki IIIS bakteriler , polisakkarit kapsül açısından, ısı ile öldürülmüş hücrelerden elde edilen IIIS suşuna benziyordu. Canlı, avirülant IIR bakterilerin zerk edildiği kontrol sıçan sağlıklı İSE 1.IIS hücrelerinin mutasyona uğrama olasılığı ortadan kalkar 2. Canlı IIR ve ısı ile öldürülmüş IIIS hücreleri arasında bir etkileşim olmalıdır. Bu etkileşimi “transformasyon” olarak adlandırdı. Transformasyon gerçekleştiren ana maddenin polisakkarit kapsülün bir kısmı yada kapsül sentezinde rol alan bir bileşik olabileceğini önerdi.

Griffith’in çalışmaları 1931- in vitro test tüpünde Dowson tarafından 1933- Alloway ve ark tarafından doğrulandı.

Oswald T. Avery’s Transformation Experiment - 1944 Transformasyon yapan maddeyi saf olarak elde etmiş ve bu molekülün DNA olduğunu kanıtlamışlardır. İzolasyon için, IIIS virülant hücreleri büyük ölçekli (50-75 litre) olarak üretmişlerdir. Santrifüj-->ısı ile öldürme işlemi-->homojenizasyon--> transformasyon kapasitesinde olduğu düşünülen çözünür süzüntü--> kloroform--> proteinleri süzüntüden ayırma-->enzimatik olarak polisakkaritleri ayırma-->etanol ile çöktürme-->ipliksi çökelek (10-25 mg aktif faktör) RNAase, Proteaz, Dnase ile muamele

Avery, MacLeod, and McCarty Deneyi

Oswald T. Avery’s Transformation Experiment - 1944 “IIIS” DNA Griffith’s sonuçlarındaki genetik materyaldir (RNA değil). Peter J. Russell, iGenetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.

Avery ve arkadaşları yayınladıkları makalede “Sunulan kanıtlar, deoksiriboz tipinde bir nükleik asidin, Pneumococcus Tip III’de transformasyon prensibinin temel birimi olduğu desteklemektedir” demişlerdir. Bu tip nükleik asitler yalnız yapısal olarak önemli değil, aynı zamanda pnömokok hücrelerinin karakteristik özelliklerini ve biyokimyasal yapılarını da saptamada fonksiyoneldir. Transformasyon maddesi bir dizi enzimatik reaksiyon ile IIR hücreleri ile etkileşime girerek IIIS kapsül polisakkaritinin sentezine yol açmaktadır. Transformasyon bir kez gerçekleşince kapsül polisakkariti diğer kuşaklarda da sentezlenir yani transformasyon kalıtsaldır.

Hershey-Chase Bacteriophage Experiment - 1953 E.colinin konakçısı olduğu virüslerden T2 fajı ile çalışmışlardır. Kısaca faj olarak adlandırılan virüs, çekirdek (kor) DNA’yı çevreleyen protein bir kılıf içerir. Altıgen bir baş ve kuyruk kısmı vardır. Fig. 2.4 Structure of T2 phage

Fig. 2.5: Life cycle of virulent T2 phage:

Hershey ve Chase faj üremesini tanımlamak için yaptıkları deneylerde şu sonuçları elde ettiler. T2 fajları yaklaşık % 50 protein ve % 50 DNA içeriyordu. Enfeksiyon fajın kuyruk liflerinin bakteri hücresine yapışması ile başlıyordu. Yeni virüs partikülleri bakteri hücresinde üretiliyordu. Görünüşe göre fajın DNA ve/veya protein bileşeni bakteri hücresine girerek viral üremeyi yönlendiriyordu. Bu bileşen hangisi idi?

Label Protein with 35S (Şekil a 1,2 ) Bunun için E.coli hücreleri 32P yada 35S bulunan ortamlarda üretilip ardından t2 virüsü ile enfekte edilirse sırasıyla radyoaktif işaretli DNA ve proteinler ortaya çıkar. Label DNA with 32P Label Protein with 35S (Şekil a 1,2 ) 3. İki farklı tipte işaretlenen T2 fajı ile E.c oli enfekte edilir. 4. 32P bakteri ve progeny fajında gözlenirken, 35S bakteride bulunmaz ancak faj çökeltisinde gözlenir. Fig. 2-6: Hershey-Chase Bacteriophage Experiment - 1953 1969: Alfred Hershey

Hershey-Chase Experiment

Hershey ve Chase’in deney sonuçlarına göre; Fajın protein kısmı konakçı hücrenin dışında kalmaktave yeni fajların oluşumunu yönlendirememektedir. Faj DNA’sı ise konakçı hücreye girer ve fajın çoğalmasını sağlar. Kalıtsal materyal DNA’dır.

Transfeksiyon Deneyleri Hershey-Chase sonrası bakteri virüsleri ile yapılan çalışmalar; 1957- E. Coli+lizozim= bakteri hücre duvarı yıkılır, sadece hücre zarı kalır ( Bu yapıya sferoplast yada protoplast denir) John Spizizen ve Dean Fraser, sferoplastlar kullanıldığında, parçalanmış T2 partiküllerinin de faj üremesini başlatabileceğini göstermişlerdir. 1960- George Guthrie ve ark. OX 174 fajından DNA (halkasal, 5386 bç) saflaştırıp E coli protoplastlarına ilave etmişlerdir. Tam bir bütünlüğe saip oX174 bakteriyofajlarını elde etmişlerdir. Böylece olgun virüs üretimi için gerekli bilgiyi DNA’nın tek başına taşıdığı kesin olarak gösterilmiştir. Sadece viral nükleik asit kullanılarak başlatılan bu enfeksiyon işlemine “transfeksiyon” denir.

DNA’nın ökaryotlarda genetik materyal olduğunun kanıtları Indirekt DNA’nın Dağılımı Mutasyon oluşturma Direkt Recombinant DNA Technology Transgenics