TANISAL MOLEKÜLER BİYOLOJİK YÖNTEMLERİN TEMEL PRENSİPLERİ VE KLİNİK ÖNEMİ Dr.Hüsnü PULLUKÇU

Plazmit analizi DNA dizi analizi Ribotipleme Polimeraz zincir reaksiyonu Ligaz zincir reaksiyonu MTD HBV DNA hibridizasyon HPV DNA ve tiplendirme

MOLEKÜLER BİYOLOJİK YÖNTEMLER HIZLI DUYARLI TANI KOYDURUCU PAHALI LABORATUVAR DONANIMI DENEYİMLİ PERSONEL

TEMEL BASAMAKLAR HİBRİDİZASYON TEKNİĞİ AMPLİFİKASYON TEKNİĞİ

HİBRİDİZASYON Klinik örnekte bulunan etkenin genomik yapısının ayrıştırılarak kendisine uygun nükleik asit probu ile bağlanması

NÜKLEİK ASİT PROBLARI Aranan etkenin genomik yapılarına özgül ve duyarlı DNA yada RNA hedeflerle hibridizasyon Yüksek spesifiklikle hedef nükleik asite komplementer bağlanma 20-1000’lerce baz çift uzunluğu Oligonükleotitler 50 baz çiftten kısa hedef moleküllere daha hızlı bağlanma

HİBRİDİZASYON YÖNTEMLERİ Katı fazlı hibridizasyon Dot blot Southern blot Northern blot Sıvı fazlı hibridizasyon İn-situ hibridizasyon

İNSİTU HİBRİDİZASYON-1

İNSİTU HİBRİDİZASYON-2

İNSİTU HİBRİDİZASYON-3

AMPLİFİKASYON TEKNİKLERİ Prob amplifikasyonu QB replikaz Ligaz zincir reaksiyonu Sinyal amplifikasyonu branched-DNA (Dallanmış problar) Diğer (enzim, radyoizotop, florokrom boya arttırımı) Hedef nükleik asitin çoğaltılması PZR (polimeraz zincir reaksiyonu) TMA (transkripsiyon aracılı çoğaltma) SDA (İplikçik uzaklaştırarak çoğaltma)

PROB ÇOĞALTILMASI Testin temel basamağı ortama eklenen probların çoğaltılması QB replikaz LZR (Ligaz zincir reaksiyonu)

QB REPLİKAZ

LİGAZ ZİNCİR REAKSİYONU

SİNYALLERİN ÇOĞALTILMASI Hedef nükleik asite bağlanmış olan enzim, florokrom boya, radyoizotop gibi işaretlerin çoğaltılması Fazla sayıda enzim, fazla sayıda prob İkinci sıra enzim ve prob Dallanmış DNA (branched DNA) HBV-DNA hibridizasyon

DALLANMIŞ PROB (b-DNA)-1

DALLANMIŞ PROB (b-DNA)-2

DALLANMIŞ PROB (b-DNA)-3

HBV DNA HİBRİDİZASYON TESTİ-1

HBV DNA HİBRİDİZASYON TESTİ-2

HEDEF NÜKLEİK ASİTLERİN ÇOĞALTILMASI Örnekte az sayıda bulunan mikroorganizmalara ait nükleik asitlerin saptanması Kantitatif olarak uygulamak mümkün PZR ( Polimeraz zincir reaksiyonu) MTD ( M.tuberculosis Direkt Test)

POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU

TMA (Transkripsiyon Aracılı amplifikasyon)

SORUNLAR Nükleik asit kontaminasyonu İnhibitör maddeler Standardizasyon yok Yüksek maliyet Yanlış tetkik istemleri