EMBRİYO GELİŞİMİNDE KOKÜLTÜRÜN YERİ Bio. Semra Sertyel ALMAN HASTANESİ IVF LABORATUARLARI EMBRİYO GELİŞİMİNDE KOKÜLTÜRÜN YERİ

YÜT’de başarıyı etkileyen faktörler Kadın yaşı Erkek Faktörü Uygun olmayan stimülasyon protokolleri Oosit matürasyonu Kromozomal ve/veya nükleer anomaliler Büyüme faktörü eksikliği Suboptimal kültür şartları

Embriyo Kültür Ortamı Emriyo gelişimi hakkında bilgimiz her geçen gün artmasına rağmen, gelişen bir embriyo için gerekli ihtiyaçların tümünü karşılayabilen bir embriyo kültür ortamı henüz tanımlanamamıştır.

Ko-Kültür Döllenmiş gamet hücrelerinin embriyo transfer işlemine kadar olan süre içerisinde tek bir düzlemde çoğaltılarak kültüre edilen özel somatik hücreler ile aynı ortamda geliştirilmesidir. Önceki ART denemeleri konvansiyonel kültür ortamlarında gerçekleştirilmiş, TİB tanısı konmuş hasta grubuna ko-kültür bir alternatif olarak sunulmaktadır. (Simon C. 2000, Spandorfer 2002)

Ko-kültür (Endikasyonlar) En az iki başarısız ART denemesi Gelişen embriyolarda belirgin yavaş gelişim izlenmesi (3.günde <6 blastomer ) Kötü Morfolojide embriyo gelişimi (düzensiz klivaj,uneven blastomer, yüksek fragmantasyon)

ÇALIŞMA MEKANİZMASI Etki mekanizması henüz tam olarak açıklanamamıştır. Ortamdaki potansiyel toksik maddelerin uzaklaştırılması Büyümeye yardımcı faktörlerin ortama salgılanması Toksik Maddeler Büyüme Faktörleri

Ko-kültür Hücre Tipleri Sheep oviduct epithelial cells (Bongso 1992, Gandolfi 1989 ) Bovine fibroblastic cells (Yeung 1992 , Wiemer 1989) Vero cells (Menezo et al., 1990) Human ampullary cells (Lai et al.,1992) Human Granulosa cells (Plachot 1993, Quinn 1996) Human endometrial cells (Barmat 1994, Liu 1995)

Endometriyal Ko-kültür Cornell sonuçları Endometriyal ko-kültür üzerinde kültüre edilmiş embriyolarda daha düşük oranda fragmantasyon ve daha yüksek sayıda blastomer içerdikleri gözlenmiştir. Barmat L.et al.(1998) İlk hücre pasajı dondurulmuş endometrial kokültür hücreleri çözme sonrası taze kültür kalitesini sürdürebilmektedirler Liu H.( 1999) Otolog endometrial kokültür hücreleri embriyo gelişimi için gerekli gelişim faktörlerinin salgılanmasının yanısıra otokrin ve parakrin düzenlemeler ile embriyo gelişim kalitesinin artmasını sağlamaktadırlar. Spandorfer S.D.(2002)

Endometriyal Ko-kültür IVI sonuçları İnsan embriyolarının endometrial kokültür üzerinde kültüre edilmesi güvenli, fizyolojik, etik ve etkili bir yöntemdir. Simon C. et al.(1999) Kokültür üzerinde embriyo geliştirilmesi daha iyi embriyo gelişiminin sağlanması yönünden önemli bir tekniktir. Simon C.et al.(2000) Tekrarlayan implantasyon başarısızlığı gözlenmiş hasta gurubunda yüksek gebelik ve normal perinatal sonuçların sağlanması kokültür uygulamaları ile mümkün olmuştur. Simon C.(2003)

Neden otolog endometrial kokültür? İmplantasyonu Arttırır Güvenlidir Dengelidir Kontrol Mekanizması sağlar Embriyo Gelişim Kalite ve Hızını etkiler

Neden otolog endometrial kokültür? Güvenlidir Hastanın kendi hücreleri ve serumu kullanıldığı için diğer sistemlerine göre daha güvenlidir (Spandorfer et al.-2002)

Neden otolog endometrial kokültür? Dengelidir: Embriyo gelişimini destekleyen ve düzenleyen maddelerin, büyüme faktörleri ve sitokinlerin ortamda dengeli ve sürekli bulunmasını sağlar (Spanos et al.-2002 , Hung-Ching Liu et al-1999)

Neden otolog endometrial kokültür? Kontrol Mekanizması sağlar: Ortam içerisinde antioksidan sistemler oluşturarak embriyo için zararlı olabilecek metabolik artıkların embryo çevresinden uzaklaştırılmasını sağlarlar (Bo Sun Joo et al.-2001)

Neden otolog endometrial kokültür? İmplantasyonu Arttırır: Endometriyal hücrelerin embriyonik parakrin molekül salgılanması (3 integrin) sonucu özellikle TİB hastalarında endometrial reseptivite arttırılır (De Los Santos et al.1998)

Neden otolog endometrial kokültür? Embriyo Gelişim Kalite ve Hızını etkiler: TİB hastalarının 3. gün embryo gelişiminin PGT öncesi biyopsi kriterlerine daha uygun düzeye getirilmesi sağlanır (Simon et al.1999-2000)

Dezavantajları Laboratuar şartlarında yoğun iş gücü ve teknik donanım gerektirmesi Kontaminasyon riski Hücre kültürü konusunda eğitimli eleman Gerektirmesi Konvansiyonel kültür ortamlarına göre çok daha fazla zaman alması

Uygulama Grubu >38 ♀ yaş altı olgular Şiddetli erkek faktörü içermeyen olgular 5 MII üzeri oosit eldesi

Otolog Endometriyal Ko-Kültür Strateji 6 Transfer 5 4 1 Biyopsi 3 2

Endometriyal Hücre vitalite ölçümü %4’lük trypan blue (%4) (Sigma t-8154) Ekim:300.000 canlı hücre/well

Otolog Endometriyal Ko-Kültür Strateji Stromal Hücreler Glandular Hücreler 300 000 vital hücre/well We have developed a unique atologous endometrial coculture system using first passaged – cryopreserved stroma and glandular epithelial cells. Nunc kültür kabı yüzeyi

EMBRİYO GELİŞİMİ

EMBRİYO GELİŞİMİ

AECC-Strategy Vimentin Resimde embriyo kültürü için nunc kültür kabına %50/%50 oranında karıştırılarak ekilen stromal/glandular hücre grubu içerisinden stromal hücrelerin Vimentin antikoru ile işaretlenmesi görülmektedir. Yeşil olarak sitoplazması boyanan hücreler stromal hücrelerdir. Nükleuslar mavi (DAPI ile) boyanmıştır. Sadece mavi noktalar çekirdek boyaması gerçekleşmiş fakat stromal olmayan hücreleri göstermektedir. Vimentin

Resimde embriyo kültürü için nunc kültür kabına %50/%50 oranında karıştırılarak ekilen stromal/glandular hücre grubu içerisinden stromal hücrelerin Cytokeratin antikoru ile işaretlenmesi görülmektedir. Yeşil olarak sitoplazması boyanan hücreler epitel glandular hücrelerdir. Nükleuslar mavi (DAPI ile) boyanmıştır. Sadece mavi noktalar çekirdek boyaması gerçekleşmiş fakat glandular olmayan hücreleri göstermektedir. Cytokeratin

Endometriyal Ko-Kültür 3.Günde <6 blastomer sayısı olan dondurulmuş-çözülmüş embriyolar kullanılmıştır (n=37) Grup A: Rutin kültür ortamı +20µg/ml IGF-1 Grup B: Endometriyal stromal hücreleri+Ham’s F-10 +%10 MS Embriyo gelişimi 3.günden 6. güne kadar gözlenmiştir. Cornel grubu bu deneyde 37 embriyonun bir kısmını rutin kültür ortamına konmuş ve IGF eklenmiş.İkinci grup endometrial stromal hücrelerin üzerine konmuş.3.günden 6. güne kadar embriyolar gözlenmiş.(Amaç kokültür hücrelerinin growth faktör salınımını ve bunun embriyo tarafından kullanımının hücrelerce aktive edildiğini ispatlamak.) Hu Ching Liu et al., (1999)

Endometriyal Ko-Kültür Konvansiyonel Kültür Ortamı Endometriyal Ko-kültür 2.Grupta ıgf ve ıgf receptor expresyonu 2 katından fazla gözlenmiş.buda endometrial hücrelerin embriyonun ihtiyacı ölçüsünde ortama growth faktör salgıladığını ayrıca bunun kullanımı için recertör aktivasyonu salgıladığını gösteriyor. IGF ve receptör ekspresyonu Blastosist oluşum oranı: %18,1 %51,8 Hu Ching Liu et al., (1999)

Endometriyal Ko-Kültür %68 %40 %34 %18 %14 %16 %20 %12 İkinci grupta dejenerasyon ve yavaş gelişim daha düşükken blastosist oluşumu daha başarılı bulunmuş.Sonraki yıllarda aynı grup diğer growth faktörler içinde aynı snuçları elde edip yayınladı. Hu Ching Liu et al., (1999)

Simon’un bu çalışmasında scanning EM çalışmaları sonrası fertil ve infertil kadınların endometrial hücreleri arasında fark olmadığı gözlenmiş. Aynı şekilde dondurulmuş ve taze monolayer coculture kültürleri arasında da bir fark saptanmamış. EM tekniğinin scanning olması nedeni ile hücre yüzeylerinin taranmış olduğu ve hücrelerin yüzey özellikleri karşılaştırılarak değerlendirildiği vurgulanabilir.

Ko-kültür:Çalışma dizaynı TİB olguları gebelikleri; kadın yaşı, önceki deneme sayısı ve elde edilmiş MII oosit sayı ortalamalarına göre ikiye ayrılarak değerlendirildi. 1.grup: Tüm denemeleri konvansiyonel kültür ortamında gerçekleştirildi (369) Önceki deneme ortalaması: 4,8 siklus 2.grup: Hastaların son denemeleri kokültürde gerçekleştirildi (389) Önceki deneme ortalaması: 3,3 siklus

♀Yaş Ortalamasına Göre Gebelik Sonuçları (%) p<0.05

ART Deneme Sayısına Göre Gebelik Sonuçları (%) p<0.05

Elde Edilen MII Oosit ortalamasına Göre Gebelik Sonuçları (%) p<0.05 Bu slaytı çıkarabiliriz

SONUÇ TİB olgularında tüm denemeleri konvansiyonel kültür ortamında gerçekleştirildiği takdirde gebelik ancak ortalama 4.8 deneme sonrası sağlanabilmektedir. Daha önce ortalama 3,3 başarısız konvansiyonel kültür denemesi olan grupta ise kokültür uygulaması sonrası gebelik elde etmek mümkün olmuştur.

SONUÇ Önceki deneme sayı ortalamalarına, elde edilen MII oosit ortalaması ve kadın yaşına göre bu gebelikler incelendiğinde kokültür grubunun gebeliklerinin daha yüksek olduğunu görüyoruz.

SONUÇ Tüm yaş gruplarında endometrial kokültür avantaj sağlamakla birlikte her iki grupta 38 yaş altında daha effektif başarı göstermektedir.

Açıklanamayan tekrarlayan implantasyon başarısızlığı olgularında endometriyal ko-kültür uygulamaları embriyo kalitesini ve gebelik şansını arttırmaktadır.

TEŞEKKÜRLER…