Ilıman İklim Meyve Türlerinde Çeşit ve Tiplerinin Moleküler Tekniklerle Karakterizasyonu Arzu SEZER Fındık Araştırma Enstitüsü Giresun

Corvallis, OREGON ABD 28 Aralık 2007-28 Şubat 2008

Department of Horticulture Prof.Dr. Shawn MEHLENBACHER (Fındık Islah ve Genetiktisi)

National Clonal Germplasm Repository Dr. Nahla BASSIL (Moleküler Genetikçi))

OSU Fındık Islah Programı Amaç: “Eastern filbert blight”’a dayanıklı çeşitler İç fındık market taleplerine uygun çeşitler Kozalak akarına dayanıklılık Orta büyüklük, yuvarlak şekil Yüksek iç yüzdesi Erken verime yatma ve yüksek verim Kolay beyazlama özelliği Az kusur (boş, küflü, ikiz vs.) Erken olgunlaşma Kendiliğinden dökülen meyve EFB’a dayanıklı süs bitkisi olarak çeşitler

OSU Fındık Islah Programı Her yıl: 40 melezleme 100’er fidan (toplam 4000 adet/yıl) 7.yılda 20 adet ağaç 8.yılda en iyi seleksiyonlarla proses yeniden başlıyor.

OSU Fındık Islah Programı: 6 yeni çeşit 8 tozlayıcı 2 süs bitkisi

The National Clonal Germplasm Repository Gen bankası Ilıman İklim Meyveleri Sert kabuklu Meyveler Diğer Ürünler

National Clonal Germplasm Repository İn vivo koleksiyon: 670 fındık ağacı 37 farklı ülkeden 355 çeşit 19 Corylus türü İn vitroda orta vadede saklama Cryopreservation ile uzun süreli saklama

Moleküler Yöntemler Mikrosatellit DNA (SSR) markırları ABD fındık koleksiyonundaki bazı örneklerin parmakizi analizi AFLP yöntemi Bazı böğürtlen çeşitlerinin karşılaştırılması

Moleküler Yöntemler (Moleküler Markırlar) Genetik Kaynak Yönetiminde Çeşitlerin tanımlanması Farklılıkların değerlendirilmesi Duplikasyonların giderilmesi Islah Programlarında MAS - Marker-assisted selection (Markır Destekli Seleksiyon) Haritalama

Yöntem Seçimi A. DNA dizisi biliniyorsa SSRs (Simple Sequence Repeat Markers) Microsatellite Markers = Basit Dizi Tekrarları B. DNA dizisi hakkında bilgi yoksa RAPD (Random Amplified Polymorphic Markers) = Rastgele oligonükleotid primerleri ile çoğaltılmış polimorfik DNA AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) =Çoğaltılmış parça uzunluğu polimorfizmi

Moleküler Analiz Basamakları (1) Örneklerin toplanması 125 130 132 140 (2) DNA Ekstraksiyonu (3) PCR (4) Electrophoresis agarose gel elecrophoresis-capillary elecrophoresis (5) Marker Analizi

(1) Örneklerin toplanması

(2) DNA Ekstraksiyonu 1-Genç dokulardan 2-Puregene kit (Gentra Systems) protokol (2 x 96 örnek) 3-DNA konsantrasyonunun ölçümü ( VICTOR V multilabel plate reader (Perkin Elmer) 4-İstenen konsantrasyonun ayarlanması

Doku ezici Mixer Mill 301

3- PCR

DNA PCR için hedef bölge kromozom çekirdek Çift sarmal DNA molekülü nükleotidler PCR için hedef bölge

İplikciklerin ayrılması (denaturasyon) PCR ile DNA Çoğaltımı İplikciklerin ayrılması (denaturasyon) 5’ 3’ Kalıp DNA 5’ 3’ Primerlerin ilavesi (annealing)) 5’ 3’ Forward primer Reverse primer 5’ 3’ Kopyaların oluşması (extend primers) 32 döngüde 1.07 milyon kopya

PCR komponentleri • Steril deionize su • 10X PCR buffer • dNTP mix • Primer • Taq DNA polymerase • MgCl2 • DNA

(4) Electrophoresis •Agarose gel electrophoresis (Ethidium Bromidele boyama ve UV görüntüleme) • Acrylamide gels (gümüş nitrat veya radyoizotop kullanarak) • Otomatik sequencer’da capillary electrophoresis (floresan etiketli primerler kullanarak)

(5) Marker Analizi

CEQ™ 8000 Genetic Analysis System

Fluorescently labeled run on capillary DNA “Sequencer”

Fragment Analizi

Simple Sequence Repeats (SSRs) Mikrosatellitler? 1-6 bp nucleotid tekrarları . (GAAG)12

SSRs-Mikrosatellitler 240 bp AT10AT14 240 bp 248 bp AT14 248 bp

Primer3 kullanarak primer dizaynı SSR Marker Geliştirme Mikrosatellit kaynaklarının tespiti (kütüphaneler, GenBank) Microsatellit Belirleme (SSRIT, BLAST, …) Primer3 kullanarak primer dizaynı Gradient PCR (Ta) Polymorpfizmin taranması (agarose) Fragment analizi (floresan forward primerler kullanarak)

A B İki SSR lokusuna göre iki çeşit arasındaki farklılığın fragment analizinde gözlenmesi

Genetik Parmakizi Çeşit SSR Lokusu Name CA112 CA169 CA190 Atlantic 142/148 109/112/115/127 240/243/246 Aurora 142/144/146 109/112/121 240/243 Bluecrop 142 109/115 240 Bluejay 142/144/146/148 115/121 Blueray 142/144/148 109/112/115 Bluetta 112/115/118/121 240/246 Cabot 142/144/149 112/115/121/127 Chandler 142/144 109/115/121/127 Coville 109/112/115/121 Draper Duke 112/115

SSRs Avantajları: Dezavantajları: Ko-dominant ve locus-specific markırlar Yüksek oranda polimorfik Genomda bol sayıda ve rastgele dağılmışlardır Laboratuarlar arasında paylaşımı kolaydır Yüksek genotiping özelliği Dezavantajları: İlk Markır geliştirme pahalı ve çok zaman alıcıdır Taxa-spesifik

SSRs Uygulama Çalışması

USDA National Clonal Germplasm Repository İn vivo koleksiyon: 670 fındık ağacı 37 farklı ülkeden 355 çeşit 19 Corylus türü İn vitroda orta vadede saklama Cryopreservation ile uzun süreli saklama

Yedek Corylus Koleksiyonu (Parlier, CALIFORNIA) 1996-1997’de Parlier, California’da yedek Corylus koleksiyonu Koleksiyonu Eastern Filbert Blight (EFB)’a karşı korumak amacıyla 184 örnek

29 yedek koleksiyon ağacı atipik veya karışık morfolojide Problemler! Corvallis Ana Koleksiyon: Kendinden köklü ağaçlar Parlier Yedek Koleksiyon: Aşılı ağaçlar 29 yedek koleksiyon ağacı atipik veya karışık morfolojide

Amaç İki koleksiyondaki DNA’ların SSR’lar ile karşılaştırılması 12 SSR’lık parmakizi analiz setinin test edilmesi 29 örneğin tanımlanmasını güncellemek

Fingerprinting Set Primer Multiplex Tag Ta (°C) Size Range CAC-B028 1 D4 55 260-284 CAC-A040 D3 62 240-254 CAC-B619 155-183 CAT-B501 D2 64 105-137 CAC-B617 2 59 284-300 CAC-B753 222-248 CAC-C040 172-201 CAC-B776 65 138-150 CAC-B657 3 212-230 CAC-C028 60 CAC-B606 254-280 CAC-B719 290-304

Genetik Parmakizi ID Primer-B028 Primer-B501 77.001C 258/274 120/134 260/272 134/138 8.001P1 8.001P2 266/272 126/128

Cluster Analysis, PowerMarker 0.1 Closca Molla P Closca Molla C TGDL P TGDL C Artellet P2 Artellet P1 Artellet C Louisen Zell P Louisen Zell C Pallagrossa P Pallagrossa C Kunzemuller Zell P Kunzemuller Zell C Tonda Bianca C Kruse P Kruse C Butler P Butler C Royal P Royal C Freehusker P Freehusker C Cosford P Cosford C Istrska Okrogloplodna P Istrska Okrogloplodna C Tonda di Giffoni P Tonda di Giffoni C Tombul Ghiaghli P Garibaldi P Garibaldi C C.hyb. NY104 P C.hyb. NY104 C Gasaway P Gasaway C Dundee P Dundee C Morrisoka P Morrisoka C Laroka P Laroka C C.hyb. Chinese Trazel J1 P C.hyb. Chinese Trazel J1 C Tonda Bianca P Negret P1 Negret C Grifoll P Grifoll C SantJ aume P Sant Jaume C Negret P2 Tonda Romana P Tonda Romana C Tombul Ghiaghli C Bulgaria XI8 P Bulgaria XI8C Yanlış etiketlenmiş ağaçlar: ‘Tonda Bianca’ ‘Tombul Ghiaghli’ ‘Negret’

SSR Fingerprinting Panel Verifies Tree Identities in Backup USDA Hazelnut Genebank Nahla Bassil1, J. Postman1, K. Hummer1, M. Botu2 and A. Sezer3 1USDA-ARS, NCGR, Corvallis, OR 2Fruit Growing Research & Extension Station, Valcea, ROMANIA 3Hazelnut Research Institute, Giresun, TURKEY

UV transilluminator ile görüntüleme RAPD (Random Amplified Polymorphic Markers) DNA İzolasyonu 10 bp’lık primerlerle PCR Agarose gelde ayrım UV transilluminator ile görüntüleme

RAPD Marker Avantajları Dezavantajları Basit PCR Düşük Maliyet Universal primerler Dezavantajları Düşük tekrarlanabilirlik

AFLP Prosedür: - Restriksiyon-Digestion - Adaptor Ligation - Amplification - Electrophoresis

Restriksiyon-Digestion Adaptor Ligation Amplification Electrophoresis

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) =Çoğaltılmış parça uzunluğu polimorfizmi

AFLPs Örnek EFB R ile ilişkili olabilecek bir markır A8 B1 R S R R R S S S R R R S R R R S S S AFLPs Örnek EFB R ile ilişkili olabilecek bir markır Source: Joel Davis Source: Joel Davis

AFLPs Avantajları Dezavantajları Yüksek tekrarlanabilirlik Yüksek multiplekslik oranı Yüksek genotyping gücü Dezavantajları Yüksek kalitede DNA gerektirir Dominant marker

AFLPs Uygulama Çalışması NCGR’de mikroçoğaltım ile çoğaltılan bazı böğürtlen çeşitlerinde somoclonal varyasyon?

2 farklı ana bitki Toplam 15 örnek Varyasyon yok

TEŞEKKÜRLER