Özel Konakta İnfeksiyon Etkenlerin Saptanması: Viruslar Doç. Dr. Murat Günaydın Ondokuz Mayıs Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji AD.

Virolojik Tanı Metotları Direkt inceleme İndirekt inceleme Serolojik yöntemler

Direkt İnceleme Antijen gösterme Elektron mikroskobisi İmmunfloresan, ELISA vb. Elektron mikroskobisi Virus morfolojisi, İmmun elektron mikroskobisi Işık mikroskobisi Histolojik görünümler, İnklüzyon cisimcikleri Viral genomu gösterme Spesifik nükleik asit probları ile hibridizasyon, Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), vd.

Viral Antijenlerin Gösterilmesi ile Hızlı Viral Tanı İmmunfloresan testler Avantaj Kısa sürede sonuç (bir kaç saat) Sorunlar Duyarlılık hücre kültürüne göre oldukça düşük Özgüllük daha zayıf Numune kalitesi önemli Prosedürler sıkıcı ve zaman alıcı

Moleküler Teknikler Viral genomun gösterilmesine dayalı testlerdir Duyarlılık ve özgüllükleri çok iyidir Rutin viroloji laboratuarlarında konvansiyonel metotlara göre hala sınırlı kullanılmaktadır Bir çok laboratuara moleküler metotlar hızla yerleşmektedir. Viral tanıda her geçen gün önemi artmaktadır

Moleküler Teknikler Klasik moleküler teknikler PCR Dot-blot, insitu hibiridizasyon ... Özgüllük hibridizasyon şartlarına bağlı değişir Duyarlılık konvansiyonel metodlardan daha iyi değil ve pahalı PCR Hedef DNA sekanslarının invitro spesifik çoğaltılması Duyarlılık ve özgüllük çok iyi

Diğer Moleküler Teknikler bDNA duyarlı bir hibridizasyon tekniğidir, linear bir çoğalma sağlar LCR, NASBA, TMA gibi teknikler signal yada hedef çoğaltma temeline dayanırlar Duyarlılık klasik teknikler ile PCR arasındadır Diğer moleküler teknikler amplifikasyonun şekline bağlı olarak değişir DNA chip teknolojisi’de son dönemde populer olmuştur. Birçok virusu aynı anda araştırmayı, hatta aynı anda ilaç direnç durumunu ortaya koyabilmektedir

İndirek inceleme Hücre kültürü Embriyonlu yumurta Hayvan deneyleri Sitopatik etki (CPE) Hemabsorpsiyon İmmunfloresan Embriyonlu yumurta CAM’da pocks Hemaglütinasyon İnklüzyon cisimcikleri Hayvan deneyleri Hastalık Ölüm

Hücre Kültürü Klasik hücre kültürü Hızlı hücre kültürü Sitopatik etki, hemadsorbsiyon Süre uzun ( 4 hafta) Numune kalitesine bağlı duyarllık ve özgüllük Kontaminasyon, yoksik maddelerden etkilenme Her virus için uygulanamaz Hızlı hücre kültürü Shell vial Kültürde viral antijenlerin 2-4 gün sonra gösterilmesi esasına dayanır Daha hızlı ve özgül

Seroloji Klasik teknikler Yeni teknikler Kompleman fiksasyon testi Radioimmun assay (RIA) Hemaglütinasyon inhibisyon testi Enzim immun assay (ELISA) İmmunfloresan teknikler Partikül aglütinasyon Nötralizasyon testleri Western blot (WB) Counter immun elektroforez RIBA, Line immun assay

Seroloji Serolojinin yararı, virusa bağlı olarak değişebilir Respiratuar viruslarda olduğu gibi birçok virus infeksiyonunda, klinik hastalıktan sonra antikorlar ortaya çıkar. Serolojik tanı genellikle retrospektif olarak konur ve bu nedenle bu tür hastalarda kullanışlı değildir Akut ve konvelasan dönem serum örneklerinin birlikte değerlendirilmesi için uzun bir süreye ihtiyaç vardır Benzer viruslarda antijenik çapraz reaksiyon, dolaysıyla yanlış pozitiflik

Seroloji’de kriterler Primer infeksiyon tanısında kriterler Akut ve konvelasan dönemler arasında IgG veya total Antikor titresinde en az 4 kat artış Tek ölçümde IgG veya total Antikor titresinin çok yüksek olması- çok güvenli değil IgM cinsi antikorların gösterilmesi Serokonversiyon Reinfeksiyon tanısında kriterler IgM antikorları yoktur yada çok düşük düzeydedir

Akut infeksiyondan sonra tipik profil Reinfeksiyon esnasında IgM ya yoktur ya da çok düşük seviyelerdedir

Viral infeksiyonlar Organ transplantasyonlarından sonra ve immun supresyon durumlarında viral infeksiyonlar fırsatçı ajanlar olarak karşımıza daha sık çıkar Selim seyreden viral infeksiyonların çoğu daha ağır ve ölümcül seyreder

Viral İnfeksiyon Transplantasyon sonrası İlk ay 1-6 ay > 6 ay Nozokomiyal infeksiyon 1-6 ay Fırsatçı infeksiyonlar > 6 ay Toplumdan kazanılmış infeksiyonlar

Viral İnfeksiyonlar HSV EBV,Adenovirus, Papovavirus, Parvovirus CMV başlangıç CMV Anti rejeksiyon tedavi ile birlikte VZV 1 yıl 1 5 4 3 2 6 8 9 7 Aylar Transplantasyon

Viral infeksiyonlar Bir çok viral etken için kullanılabilecek ajan mevcuttur. Toksik etkileri nedeni ile doğru kullanımları gereklidir Hastalığın çıkışını önleme Hastalığın gidişini kontrol Hızlı ve doğru tanı yöntemleri Özellikle solunum yolu infeksiyonlarında Gereksiz antibiyotik kullanımı

Viral infeksiyonlar Özel viral infeksiyonlar En önemli infeksiyon etkeni Cytomegalovirus Transplantasyon olgularının 2/3’ünde etken 1-4 ayda sık İmmunosupresif tedavi Son dönemde önem kazanan ajanlar Solunum yolunun viral patojenleri

CMV Transplant hastalarında ve immun yetmezliği olanlarda ciddi hastalıklara ve ölümlere neden olabilmektedir CMV infeksiyonu Semptom olmaksızın örneklerden virusun bulunması CMV hastalığı İnfeksiyon ile birlikte semptomların eşlik etmesidir

CMV tanı yöntemleri Histoloji ve sitoloji Hücre kültürleri Konvansiyonel Hızlı hücre kültürleri Antijenemi testleri Nükleik asit göstermeye dayalı teknikler PCR ve Hibridizasyon yöntemleri mRNA saptama yöntemleri NASBA (nucleic asid sequence-based amplification) Seroloji

CMV Hücre Kültürü Konvansiyonel hücre kültürü Hızlı hücre kültürü CPE geç oluşur Kullanım için uygun değildir Direnç için kullanılabilir Hızlı hücre kültürü Monoklonal antikorlarla viral antijenlerin 24-48 saat içinde gösterilir Buffy coat daha erken pozitifleşir İdrar ve orofaringeal örneklere göre daha değerlidir

CMV Hücre Kültürü Hızlı kültür tekniği Belirli sayıda lökosit inokülasyonu Kantitatif sonuç Antiviral yanıt izlenebilir Lökositler hücrelere toksik etkili Duyarlılığını azaltmaktadır 24-48 saat içinde viremide belirgin azalma CMV antiviral ajana duyarlı 48 saatten sonra viremi devam ediyor CMV antiviral ajana dirençli?

CMV IFA A: Hücre kültürlerinde exprese edilmiş CMV antijenleri hızlı immunflorosan boyama teknikleri ile monokonal Ab kullanılarak gösterilebilir (insan fibroblasts hücrelerinin çekirdeklerinde, CMV early antijen) B: Buffy coat kullanılarak fibroblastlar CMV ile infekte edilmiş (CMV early antijenine karşı oluşmuş monoklonal antikor ile direkt boyanmmıştır.

CMV Antijenemi testi Periferik kan lökositlerinde antijen pozitifliği Aktif CMV infeksiyonu Antijenemi düzeyine göre preempitif tedaviye başlamaya karar verilebilir <50/2*105 düzeyi Asemptomatik infeksiyon Antijenemi düzeyi izlenmelidir 100/2*105 düzeyi Semptom aranmaksızın tedaviye başlanır. Direnç yoksa Antijenemi testi tedavi sonrasında negatifleşir. Tedavinin ilk haftasında antijen düzeyi artabilir Direnç olarak değerlendirilmemelidir

CMV Antijenemi testi Belli sayıda lökosit içersinde antijen pozitif hücrelerin sayımı Viral yük kantitatif olarak saptanabilir Antijenemi saptayan yöntemler Hücre kültüründen daha duyarlıdır, Hastalık bulguları ortaya çıkmadan kültürden 7-14 gün daha önce saptanabilmektedir PCR’a yakın bir duyarlılığa sahiptir Lökositlerin düşük olduğu durumlarda PCR tercih edilir

CMV Antijenemisinin Gösterilmesi Nötrofillerdeki CMV pp65 matrix proteinini gösterme Kahverengi olarak peroksidaz ile boyanmış Bu antikorlarla boyanmış Pozitif hücre sayısı infeksiyonun şiddeti ile doğru orantılı

CMV Nükleik Asit Hibridizasyon Kantitatif sonuç verilebilir Hibrid yakalama CMV DNA testi (700 kopya/ml) bDNA sinyal amplifikasyon testi (900/106 lökosit) Viral yükün düşük olduğu durumlarda izlem için uygun değildir, bDNA’nın kullanımı lökopenik olgularda sınırlıdır

CMV: Kalitatif PCR CMV PCR pozitifliği akut infeksiyonu gösterir Lökosit, serum ve plazma örneklerinde Kalitatif ve kantitatif çalışılabilir Kalitatif PCR  negatif Seronegatif ve seropozitif hastlarda CMV negatif Kalitatif PCR  pozitif Seronegatif olgularda CMV infeksiyonu Yüksek duyarlılık Kalitatif çalışmalarda seropozitif hastalarda latent virusun saptanmasına neden olabilir

CMV: Kantitatif PCR Latent/aktif infeksiyon ayırımında Tedavinin izlenmesinde Periyodik testlerde viral yükün artması tedavi endikasyonu kabul edilir Tedavi bitiminde testler negatifleşmeli veya viral yük belirgin oranda azalmalıdır Aksi dirence işaret eder Ticari, kantitatif, standardize Cobas amplicor CMV monitor testi Duyarlılığı >400 kopya /ml Yeni, kullanışlı, hızlı testler Real-time PCR

CMV: mRNA saptama CMV’nin yapısal proteinlerini kodlayan genler Aktif infeksiyon sırasında transkripte edilir Spesifik mRNA dizilerinin saptanması aktif infeksiyonu gösterir IE-mRNA, E-mRNA, L-mRNA Buna yönelik RT-PCR ve NA sekans esaslı amplifikasyon testleri yapılabilir (NASBA) Ticari olarak mevcut olan bu test de standardizedir Kalitatif olarak sonuç verir, ancak geç proteinlerden biri olan pp67 mRNA dizilerinin araştırılması hem aktif CMV’yi göstermede hem de tedaviye yanıtı takipte denenebilir

CMV: Seroloji Transplant hastaları için uygun değildir Serolojik testler aktif infeksiyonu göstermede yetersiz kalır IgG antikorları geçirilmiş infeksiyonu gösterir IgM akut infeksiyonu göstermesi beklenir, Ancak değişik zamanlarda da pozitif saptanabilir Çapraz reaksiyonlar tanıyı karıştırabilir Avidite testleri denenebilir

CMV: Flow Sitometri CMV antijenleri çok erken ve duyarlı olarak bu yöntemle saptanabilir CMV DNA floresan insitu hibridizasyon tekniğine uyarlanarak duyarlılık artırılabilir CMV’e karşı oluşmuş spesifik sitotoksik T lenfositler saptanabilir ve tanıya farklı bir boyut getirebilir

CMV Sonuç Yeni gelişen teknikler Transplant sonrası Doğru ve zamanında tedavi Mortalite de düşme Transplant sonrası CMV’nin en sık görüldüğü ilk 4 ayda Kantitatif sonuç veren testlerden biriyle haftada 1 izlenmelidir. İki farklı testin kullanımı maliyet göz ardı edilirse duyarlılığı artırabilir

Solunum Yolu Viral Ajanları İmmunkomprimise hastaların solunum yolu infeksiyonlarında viral ajanlar özellikle son dekadda dikkat çekmektedir Viral infeksiyonlarla birlikte ölüm riski artmaktadır Toplumdan kazanılmış yada nozokomiyal pnömonilerde RSV İnfluenza virus, parainfluenza virus Adenovirus Picornaviruslar

Hücre kültürü Hücre kültürü altın standart dır Hızlı tanı için uygun değil (2-10 gün) Klinik değeri sınırlı Hep-2C, R-HELA, t-MK Kültürlerde haftada 2 kez sitopatik etki gözlenir Pozitif kültürlerde, immunfloresan testlerle monoklonal antikorlar kullanılarak tanımlama yapılır

RSV Hücre Kültürü Hep-2 hücre kültüründe RSV’ye bağlı sitopatik etki. Sinsutyum oluşumu İmmunperoksidaz metotla boyanmış

Viral Antijeni gösterme İmmunfloresan testler Bir kaç saat içersinde sonuç alınabilir Hücre kültürüne göre duyarlık düşüktür Özgüllük her zaman yeterli olmaz Her virus için kit bulunmayabilir

RSV IFA Nasal yıkama suyu RSV’e karşı oluşmuş bovine antikorla boyanmıştır İnfekte mononükleer hücrelerin sitoplazmasında görülen yeşil boyanma pozitifliği gösterir

PCR Duyarlı ve özgül Nested RT-PCR Single veya multiplex PCR RSV Parainfluenza virus 1-3 Influenza virus A ve B Rhinovirusler Enteroviruslar Coronaviruslar

PCR Influenza A ve B Parainfluenza 1-3 (A:matrix protein, B:hemaglütinin geni) Parainfluenza 1-3 (hemaglutinin nöraminadaz glikoproteini) Picornaviruslar (Rhino ve enteroviruslar) (5’ nonkoding bölge) RSV A ve B (nukleokapsid proteini) Coronavirus

PCR BAL’ın üst solunum yolu florası ile kontaminasyonu Bu tür hastalar uzun süre virus salarlar Hızlı ve duyarlı yöntemlere ihtiyaç vardır Moleküler yöntemler klasik yöntemlere göre solunum yolu virus tayin hızı ve oranını büyük ölçüde artırmıştır Sonuçların klinik değeri? Daha fazla çalışmalara ihtiyaç vardır

Seroloji Çift serum örneği ile yapılacak çalışmalarda titrede en az 4 kat artış aranır Kompleman fiksasyon testi RSV, influenza A ve B, Parainfluenza 1-3, Adenovirus İndirekt immun floresan RSV, Influenza A ve B

Solunum Yolu örnekleri Bronkoalveolar lavaj (BAL), Burun Boğaz sürüntüsü Viral transport mediuma, En kısa sürede laboratura gönderilir, maksimum 24 saat +4oC’de bekletilebilir Laboratuvara gelen materyalin Materyalin bir kısmı viral kültür ve/veya antijen çalışmaları için kullanılır Kalan kısmı –70oCde saklamaya alınır, Çift serum örneği alınır

EBV Tanı Monospot testi VCA-IgG VCA-IgM EA karşı Ab NA karşı Ab % 10-15 negatif VCA-IgG Akut, geçirilmiş VCA-IgM Primer EBV infeksiyonu (1-2 ay pozitif) EA karşı Ab Akut infeksiyon NA karşı Ab Geçirilmiş infeksiyon

VZV: Tanı Transplant öncesi seroloji bilinmeli Hücre kültürü Tzank preparat Hibridizasyon PCR

HSV Biopsi Seroloji Direkt immunofloresan Tzank testi Kültür Primer infeksiyon tanısında yardımcı