DNA PÜRİFİKASYONU

DNA Genetik bilgiyi taşıyan çift sarmal moleküldür. 5C’lu şeker, fosfat ve bazları içeren nükleotidlerden oluşur. Doğadaki canlıların tümüne yakın kısmında genetik materyal DNA’dır.

DNA hücre içerisinde: Çekirdek Mitokondri Kloroplastlarda bulunmaktadır.

olmayan proteinler,HMG proteinler ve RNA dan meydana gelmiştir. DNA hücre içersinde serbest halde bulunmaz. Belli bir organizasyonu vardır. DNA nın çok büyük bir kısmı nukleusta , bir miktarı ise mitokondri ve kloroplastta bulunur. DNA molekülleri nukleuslarda da serbest halde bulunmazlar. DNA kromatin iplikçikleri ve sonrada kromatinleri verecek şekilde özel bazı proteinler ve RNA ile bir kompleks yapı meydana getirir. Kromatin yapı taşı ;DNA, histon proteinler,histon olmayan proteinler,HMG proteinler ve RNA dan meydana gelmiştir. ***High Mobility Group- hareket yeteneği yüksek grup olarak adlandırılan proteinler

Bazı kimyasal maddeler ve enzimler ile canlı hücrelere ait hücre zarı veya canlı hücre duvarının yıkılıp DNA nın ortaya çıkarılmasına DNA saflaştırılması denir.Buda yukarıda bahsedilen yapıların (histon proteinler,non-histon proteinler,HMGler) hepsinin uzaklaştırılması durumudur.

DNA PÜRİFİKASYON YÖNTEMLERİNDE BİRBİRİNİ İZLEYEN ÜÇ TEMEL AŞAMA BULUNMAKTADIR: 1- Hücrenin parçalanması ile yüksek molekül ağırlıklı DNA’nın açığa çıkması, 2-Denatürasyon veya proteoliz ile DNA-protein kompleksinin ayrılması ve DNA’nın çözünür duruma getirilmesi, 3-DNA’nın basit enzimatik ve/veya kimyasal yöntemlerle proteinler, RNA ve diğer makromoleküllerden ayrılması,

BAŞARILI BİR DNA SAFLAŞTIRILMASI İÇİN

1-Hücresel organellerin açığa çıkması için hücre duvarı kırılmalıdır İlk aşama duvarın zayıflatılmasıdır.Fiziksel olarak dondurup çözme yada kimyasal maddeler kullanılarak yapılır. 2-Hücre membranı parçalanmalıdır. Bu sayede DNA ekstrasyon buffer içinde serbest kalır.Bu genelde SDS gibi deterjanların kullanılması ile olur. 3-DNA nükleazlardan korunmalıdır. EDTA gibi deterjanlar bu yüzden kullanılır.

4-DNA protein kompleksinin çözünmesi. Buffer/doku karışımına kloroform veya fenol karışımı eklenerek DNA’dan proteinlerin ayrılması sağlanır. 5-DNA’nın kırılması en aza indirilmeli. Solusyon içersindeki DNA çalkalanarak bile kırılabilir. 6-DNA’nın ortamdaki diğer moleküllerden ayrılması. Genelde bu aşama DNA’nın fiziksel yada kimyasal etkilere maruz kalması ile sağlanır.Örneğin DNA kimyasal olarak çöktürülebilir.Bu işlemde en çok kullanılan kimyasal etanol’dür.Fiziksel uygulamada santrifüj yapılır.Santrifüj hızı ve zamanı ayrılması istenilen molekülün ağırlığına göre değişkenlik gösterir.

Enzimler(RNase) RNA’yı yok etmek için, Enzimler (Proteases) DNA molekülüne bağlı olarak bulunan proteinleri yok etmek için, İzopropanol ve etanol: Nükleik asitlerin çöktürülmesinde, Amonyum sülfat ve sodyum sülfat:Proteinlerin çöktürülmesinde, Etil asetat, Toluen, SDS membran yapısını bozmada, Saflaştırılan DNA +4°C’da uzun süre saklanabilir.

Kromozom DNA’sının Saflaştırılması Bakterilerden Mayalardan Memelilerden Bitkilerden

Bakterilerden kromozom(genom) DNA’sı pürifikasyonu: Organizma: E. coli , B. Subtilis

Bakteri kültürünün 1.5 ml’si 10.000 rpm de 5 dakika santrifüj edilir. LB(Luria Bertani) besiyerine tek koloniden ekim yapılır ve 150 devir/dakika hızda, 37°C’de bir gece bekletilir. Bakteri kültürünün 1.5 ml’si 10.000 rpm de 5 dakika santrifüj edilir. Süpernatant atıldıktan sonra Tris – EDTA (TE ph:8) tamponu içinde çözündürülür Çözelti üzerine Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) ve proteinaz K eklenir ve 37°C’de 1 saat bekletilir (bu aşamada hücreler parçalanır).

Üzerine NaCI ile NaCI/CTAB (setil trimetil amonyum bromür) çözeltileri eklenerek 65 °C’de 10 dakika bekletilir. Eşit hacimde kloroform/izoamil alkol (CIA) eklenerek 10.000 rpm’de 5 dakika santrifüjlenir. Süpernatant alınarak üzerine fenol/kloroform/izoamil alkol eklenerek 10.000 rpm’de 5 dakika santrifüjlenir. Süpernatant ayrı bir tüpe alınarak izopropanol eklenir ve DNA çökünceye alt-üst edilerek karıştırılır.(Bu aşamada DNA’nın iplikçikler şeklinde çökeldiği gözlenir)

DNA, 15.000 rpm’de 10 dakika santrifüjlenir Pelletin üzerine etanol eklenerek DNA yıkanır ve alkol geri boşaltılır. Tüpün ağzı açık durumda oda sıcaklığında (10-15 dak.) ya da 60 °C’de birkaç dakika bekletilerek alkol tamamen uçurulur. Çökelti Tris-EDTA (pH:8) içinde yavaşça vurularak çözündürülür.

PÜF NOKTALAR:

Bitki hücreleri genelde çok sayıda sekonder bileşik içerir, bunun sonucu olarak belirli türlerde yüksek düzeydeki sekonder bileşikler DNA’nın saflığını bozmaktadır.Bu sorunun üstesinden gelmek içinalternatif ekstrasyon bufferleri kullanılır. DNA ekstrasyon bufferlerı ph 8.0 hatta ph 9.0 civarında olmalıdır

Kromozom dışı DNA’nın saflaştırılması Plazmid Organel

Kromozom dışı DNA’nın izolasyonu Kromozom dışı DNA olarak bakterilerde plazmid adı verilen, sitoplazmada genom DNA’sından bağımsız replikasyon yapabilen, çift zincirli, genellikle halkasal(ender olarak doğrusal) olan DNA molekülleri bulunmaktadır. Ökaryotlarda ise nukleus DNA’sından bağımsız kalıtım gösteren organel DNA’larına mitokondri (mtDNA) ve kloroplastlarda (ctDNA) rastlanmaktadır. Mitokondri ve Kloroplast DNA’sı, çift zincirli halkasal bir molekül olamakla birlikte boyutu organizmalara göre değişmektedir.

Plazmid DNA’sı İzolasyonu Plazmitlerin rekombinant DNA teknolojisi çalışmalarında taşıyıcı DNA(vektör) olarak geniş çapta kullanılması plazmid izolasyon yöntemlerinin gelişmesine yol açmıştır.

Organel DNA’sı izolasyonu Organel DNA’sı izolasyonlarında en önemli aşama öncelikle organelin parçalanmamış şekilde ayrılması olduğundan dolayı,bu olay 2 aşamada gerçekleştirilir. ***Organelin izolasyonu ***Organel DNA’sının izolasyonu

Mitokondriyal DNA’nın saflaştırılması Mitokondri İzolasyonu Materyal: Somatik hibritlerin çeşitli bitki dokuları

Patates tuberi elektrikli meyve suyu sıkacağından geçirilir ve eşit hacimde uygun tampon eklenir. Taze dokular (yaprak, çiçek vb.) buzda soğutulmuş uygun tampon içinde parçalanır yada Naylon bir membrandan filtre edildikten sonra büyük hücre parçalarının uzaklaştırılması için 500×g’de 10’ dakika santrifüj edilir. Plastitlerin uzaklaşması için süpernatant 2600 ×g’de 15’ da 2 kez ve bir kez de 10’ santrifüj edilir. Süpernatant alınır ve mitokondrileri çöktürmek için 14.500 ×g’de 15’ santrifüj edilir. Lizis olmuş nükleus parçalarını içeren üst sıvı atılır, mitokondrileri içeren çökelti buzda soğutulmuş uygun tampon içinde çözündürülür. Mitokondri çökeltisi sıvı azotta dondurulduktan sonra -80°C saklanır yada doğrudan DNA izolasyonu yapılabilir.

Mitokondri DNA’sı izolasyonu

Mitokondri çökeltisi lizis tamponu içerisinde çözündürüldükten sonra Proteinaz K eklenerek 37°C’de 1 saat bekletilir. Amonyum asetat ve TE ile doyurulmuş fenol/kloroform eklenerek 12.000rpm’de 5’ santrifüj edilir. Süpernatant kısmı ayrı bir tüpe alınarak absolü etanol alınarak eklenerek -20 °C’de bir gece bekletilir. 18.000×g’de 20’ santrifüjlemeden sonra çökelti distile su içinde çözündürülür

ANİMASYON

SABIRLA DİNLEDİĞİNİZ İÇİN TEŞEKKÜRLER

SORULAR ?