Biyoteknolojide Kullanılan Yöntemler

... konulu sunumlar: "Biyoteknolojide Kullanılan Yöntemler"— Sunum transkripti:

1 Biyoteknolojide Kullanılan Yöntemler

2 Protein Saflaştırmada Yapılan İşlemler

3 Hücrelerin Parçalanması
Tekrarlı dondurma ve eritme (Örn: Sıvı azot) Sonikasyon (Ultrason), Mekanik Parçalama (Blender) Organik çözücülerle hücre zarının geçirgenleştirilmesi Deterjanlarla muamele

4 Ultrasonla Parçalama Ultrason ile zayıflamak mümkün mü?

5 Mekaniksel Parçalama

6 Çöktürme ile kısmi saflaştırma
Amonyum sülfat çöktürmesi İzoelektrik çöktürme Organik çözücülerle çöktürme Asit ile çöktürme Isı yoluyla çöktürme Triton X-100 veya CHAPS ile membran proteinleri sökülebilir. SDS proteinleri denatüre ettiği için bu amaç için kullanılmaz.

7 Santifüj Santrifüj ile karışımda asılı kalan maddelerin daha hızlı çökmesi salanır. Ultra santrifüj kullanılarak mitekondriler bile çöktürülebilir.

8 Diferansiyel santrifüjleme
Diferansiyel santrifüjleme. Homojenat, gittikçe artan santrifüj kuvvetine maruz bırakılarak fraksiyonlara ayrılır.

9 Denge yoğunluk gradient santrifüj yöntemi

10

11 Diyaliz Protein saflaştırmasının çeşitli aşamalarında proteinlerin küçük moleküllerden ayrıştırılması için kullanılan bir işlemdir. Örneğin, amonyum sülfat ile çökeltmenin ardından kullanılacak bir iyon değişim kromatografisi (bkz. aşağıdaki bilgili bölüm) adımı için bu tuzun giderilmesi gerekir, bunun için diyaliz yapılır.

12 Diyaliz Diyalizde, yarı geçirgen bir membran kullanılır, porlu bir selüloz membran gibi. Porların büyüklüğü proteinlerin geçmesine izin vermez ama küçük moleküller ve tuz iyonları geçebilir.

13 Diyaliz Diyaliz edilecek protein karışımı bir dializ torbasına konur, torba da büyük hacimli bir tampon çözeltisi içine yerleştirilir. Birkaç saat sonra torbanın dışındaki ve içindeki çözelti dengelenir, iki taraf küçük moleküller bakımından aynı bileşime sahip olur.

14 Diyaliz İşlemi ile tuzların uzaklaştırılması

15 Diyaliz sistem dengeye ulaşıncaya kadar devam eder

16 Jel filtrasyon kromatografisi ile de tuzlar uzaklaştırılabilir

17 Kromatografik Yöntemler
Protein Saflaştırılmasında genellikle kolon kromatografisi kullanılır. Bunlar: Afinite kromatografisi İyon değişim kromatografisi Jel filtrasyon kromatografisi

18 Kromatografi, bir karışımdaki maddelerin bir sabit faz üzerinde farklı hızlarda sürüklenmesi sonucunda birbirinden ayrılması temeline dayanır. Maddeleri sürükleyen ise bir sıvı ya da gaz olabilir

19 Karışımdaki maddeler sabit faz tarafından ne kadar alıkonuyorsa o oranda yavaş ilerler.
Örneğin; sıkışık bir trafikte taksiler durmuş iken motosikletlerin daha hızlı ilerlemesi gibi… Ya da trafik kontrolünde taşıtlar durdurulurken yayaların ilerlemesi gibi…

20 Uygulama Şekline Göre İnce Tabaka Kromatografisi Kolon Kromatografisi
Sabit faz, saflaştırılmak istenen maddenin cinsine göre değişir. Bu sabit fazı genellikle hem ince tabaka hem de kolon kromatografisine uygulayabiliriz. Tercih size kalmış.

21 İnce Tabaka Kromatografisi

22 Sabit Faz Başlangıç Hareketli Faz

23 More polar! Less polar! s o l v e n t f r i g mixture c m p B A

24 Rf değeri aynı şartlarda bir madde için aynıdır.
Rf ayırt edici bir özelliktir.

25 Elinizdeki karışımda, şüphelendiğiniz maddenin olup olmadığını İTK ile anlayabilirsiniz.
Ayrılan noktayı kazıyıp maddeyi saf olarak da elde edebilirsiniz.

26 Kolon Kromatografisi

27

28 Principles of Separation on a column

29 Principles of Separation

30 Principles of Separation

31 Principles of Separation

32 Principles of Separation

33 Principles of Separation

34 Principles of Separation

35 Kolon kromatografisi uygulanan tekniğe göre değişik alt bölümlere ayrılabilir.
İyon değişim kolonu Jel filtrasyon kolonu Afinite kolonu Hidrofobik etkileşme kolonu

36 İyon Değişim Kromatografisi
Kolondaki sabit faz çalışılan pH’da + ya da – bir yüke sahiptir. Sabit fazla zıt yükle yüklü olan maddeler kolonda alıkonurken aynı yükte olanlar alıkonmazlar.

37 Jel Filtrasyon Kromatografisi
ŞOK! ŞOK! ŞOK! Daha büyük moleküller daha hızlı ilerler.

38 Afinite Kroma.. Specific interactions

39

40 Afinite Kromatografisi
Sabit faza öyle bir molekül tutturulur ki; sadece ilgilendiğimiz molekülle etkileşir ve onu kolonda tutar.

41 Afinite kromatografisinde gerekirse uzatma kolu kullanılabilir

42 Kromatografi bir çok analiz cihazının kullandığı saflaştırma tekniğidir. Bunlardan sıklıkla kullanılan ikisi: HPLC Gaz Kromatografisi

43 Hewlett-Packard Series 1100 HPLC
Çözücüler Pompa Enjektör Kolon Dedektör

44 HPLC

45 HPLC ŞEMA

46 HPLC Chromatogram of Standard 1
0.500 x 10-4 M caffeine

47 HPLC Chromatogram of Standard 2
1.00 x 10-4 M caffeine

48 HPLC

49

50 Gaz Kromatografisi

51 Gaz Kromatografisi

52

53

54 Protenleri derişikleştirme A. Ultra Filtrasyon

55 Protenleri derişikleştirme B. Liyofilizasyon

56 Elektroforez 1D elektroforez 2D elektroforez
Doğal elektroforez (Poliakril amid, Agar) SDS-PAGE (Sodyum Dodesil Sülfat Poliakril Amid Jel Elktroforezi) 2D elektroforez

57 Elektroforezin Temeli

58 Dikey Elektroforez Proteinleri Ayırmada Kullanılmaktadır

59 Dikey Elektroforez

60 SDS’nin (Sodyum Dodesil Sülfat) Etkisi

61

62 Elektroforezden sonra boyama yapılır

63 Boyamadan sonra ise yıkama yapılır

64 SDS-PAGE ile Mol Kütlenin Bulunması

65 Yatay Elektroforez Nükleer Materyalleri Ayırmada Kullanılmaktadır
Yatay elektroforezde jel olarak agar kullanılır

66 Nükleer Materyallerin Elektroforez ile Ayrılması

67

68 İzoelektrik Fokuslama

69

70 2D Elektroforez

71 2D Elektroforez

72 DNA İzolasyonu Malzemeler 1. Lizis solüsyonu 0.5 M Tris-HCl pH 8.0, 20 mM EDTA 10 mM NaCl 1% SDS 0.5 mg/mL proteinase K 2. Doygun NaCl (6M) 3. Etanol (%96, %70)

73 DNA İzolasyonu Uygulama Basamakları
Hazırlanan lizis solüsyonundan hücre peletinin üzerine 2 mL eklenir. 37°C ‘de bir gece bekletilir. 1 mL doygun NaCL eklenir. Örnekler 55°C 10 dakika bekletilir. 30 dakika 500 g’de santrifüj edilir. Alttaki protein bölümüne dokunmadan süpernatant yeni bir tüpe aktarılır. Süpernatantın 2 katı hacimde soğuk %96’lık etanol eklenir. Tüp defalarca alt üst edilerek DNA’nın çökmesi sağlanır.

74 DNA İzolasyonu Uygulama Basamakları
Çöken DNA plastik spatula yada santrifüj ile alınarak yeni bir tüpe aktarılır. Santrifüj yapılacak ise g’de 10 dakika santrifüj edilir. Üstteki alkol fazı atılır. %70’lik alkol ile DNA bir kez yıkanır. Bunun için 1mL %70’lik alkol eklenir. Tüp alt üst edilir g’de 10 dakika santrifüj edilir. Üstteki alkol fazı atılır. DNA havada kurutulur. Distile suda DNA çözülür. Çözülmesini kolaylaştırmak için 65 0C’de 10 dakika tutulur. Elde edilen DNA dan 1/25 -1/40 dilüsyon hazırlanır. A280 / A260 oranı ölçülür (oran >1.5 olmalıdır). 280 nm’deki absorbans önce 50, sonra da dilüsyon faktörü ile çarpılır. Sonuç μg/mL olarak DNA konsantrasyonunu verir.

75 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Antijen-antikor ilişkisini, antikora bağlanmış bir enzimin aktivitesini araştırmak temeline dayanan kantitatif ölçüm yöntemidir. Antijene karşı antikor ya da antikora karşı antijen aramak mümkündür. Virüs ve parazit enfeksiyonlarında kullanılan bir tanı yöntemidir.

76

77

78 Sandviç ELISA

79 Sandviç ELISA

80 Sandviç ELISA

81 Sandviç ELISA