Tolerans İndüksiyonu Doç.Dr. Kenan Keven Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Nefroloji B.D. Transplantasyon Ünitesi

Tarihçe 1954-Murray ve Hume-Nobel 1990 1962-Kadavra Tx 1963-Akciğer-Hardy 1966-Pankreas-Kelly 1967-Karaciğer-Starzl 1967-Kalp-Barnard AZA-Steroid 1983-CsA 1994-Tacrolimus 1995-MMF 1999-Rapamune 1998- IL-2R blokerleri Campath-1H

İmmün Tolerans Olgu 2 HS, 44Y 15 yıl önce annesinden RTX RF, 35 Y, Savcı 10 yıl önce SDBY ve Babasından renal Tx - Pred-AZA-CsA Akut rejeksiyon yok, Tek haplotip uyum En son kontrol 3 ay önce ve Kreatinin=1.0 mg/dl Hasta bulantı, kusma, dispne, ödem ile acil servise geliyor Kreatinin=9.9 mg/dl İlaçlarını 2 hf. önce kesmiş Biopsi=Grade 2b rejeksiyon OKT3 Cevap yok 3/7 HD Olgu 2 HS, 44Y 15 yıl önce annesinden RTX Akut rejeksiyon yok 3MM Pred-AZA-CsA 6 ay önce kontrol; kreatinin=1.0 mg/dl Kontrole geliyor Aktif yakınması yok İlaçları 3 ay önce bırakmış Kreatinin=1.1 mg/dl Pred-AZA

Peter Medawar Nobel Lecture, Aralık 12, 1960 Immunological Tolerance The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1960 Nobel Lecture, Aralık 12, 1960 Immunological Tolerance "Immunological tolerance" may be described as a state of indifference or non-reactivity towards a substance that would normally be expected to excite an immunological response. The term first came to be used in the context of tissue transplantation immunity, i.e. of the form of immunity that usually prohibits the grafting of tissues between individuals of different genetic make-up; and it was used to refer only to a non-reactivity caused by exposing animals to antigenic stimuli before they were old enough to undertake an immunological response. For example, if living cells from a mouse of strain CBA are injected into an adult mouse of strain A, the CBA cells will be destroyed by an immunological process, and the A-line mouse that received them will destroy any later graft of the same origin with the speed to be expected of an animal immunologically forearmed. But if the CBA cells are injected into a foetal or newborn A-line mouse, they are accepted; more than that, the A-line mouse, when it grows up, will accept any later graft from a CBA donor as if it were its own. I shall begin by using the term "immunological tolerance" in the rather restricted sense that is illustrated by this experiment, and shall discuss its more general usage later on......

İmmün Tolerans Tanım ve Kavramlar 1- Allograftın immünsupresyon uygulanmaksızın immün cevaba maruz kalmadan fonksiyonunu sürdürmesi İnfeksiyoz ajanlara normal immün cevap varlığı 2- Prope Tolerans-Almost Tolerance: Hemen hemen tolerans: Alloreaksiyonu engellemek için çok düşük doz veya giderek azaltılarak minimal doz immünsupresyon uygulanması ile elde edilen tolerans 3- Metastable Tolerans: İmmunsupresyonun kesilmesini takiben uzun bir süre rejeksiyon olmadan allograft fonksiyonu devam edebilir. Bu regülatör T hücrelerinin efektör T hücrelerini baskılaması ile gerçekleşir..Ancak olay stable değil metastable..

İmmün Tolerans Gerçekleşmesi mümkün olmayan bir hayal mi? Gereksinim mi? Ne yapabiliriz? Öyle ise onu yapmalıyız?

USRDS,2005

USRDS,2005

USRDS, 2005

İmmünsupresyon Uygulamaları USRDS, 2005

İmmün Tolerance Network 1998 yılında NIH ve American Diabetes Fed. tarafından oluşturuldu Amaç transplantasyon tolerans çalışmalarına finansal destek sağlamak bu konuda yapılan çalışmaların sayısını artırmak Karaciğer, böbrek, adacık hücre nakli, otoimmün hastalıklar, allerjik hastalıklar ve astım üzerinde araştırmalar temel alınıyor www.immunetolerance.org adresinde daha geniş bilgi

İmmün Aktivasyon Elster EA et al, Transplant Immunol, 2004

T hücre Aktivasyonu Apoptozis Efektör T hücreleri ve Memory hücreleri.. Ancak bu aktivasyon Thymus ve periferde regülatör T hücre varlığı için gerekli (paradoks) Tedavi amaçlı kullanım Sharpe AH, NEJM, 2006

Heterelog İmmünite; İmmün Toleransa Bariyer

Heterolog İmmünite

Heterolog İmmünite

Tolerans İndüksiyonu Uygulanan Stratejiler Costimulation Blokaj Lenfosit deplesyonu Mix chimerism Mekanizmalar Anerji Regülasyon Delesyon

Tolerans İndüksiyonu: Modeller 1. Rodentler 2. Non-Human Primatlar 3. İnsanlar

1. Co-stimulasyon blokajı Fehr T, Transp Immunol 2004

Co-Stimulasyon blokajı İlk deneyim farelerde B7-CD28 CTLA4-Ig MoAB CD40-CD154 Deri ve kalp nakli sonrasında uzun dönem tolerans indüksiyonu Larsen CP, Nature, 1996

Co-Stimulasyon Blokajı Maymunlarda CD-154 Humanize Ab (hu5C8) indüksiyonu ile yapılan MHC mismatch renal transplantasyon Bu çalışma tolerans indüksiyonu değil akut rejeksiyonu engellemeye yönelik uzun dönem tedavi içeren bir çalışma hu5C8 kesildikten sonra 10 aydan fazla allograft fonksiyonu var Steroid ve tacrolimus hu5C8 etkisini antagonize ediyor. Uzun dönemde MLR da azalma varken donor spesifik Ab oluşumu devam ediyor ve biopside T hücre infiltrasyonu var ama hasar yok.. Kirk A, Nature Med, 1998

Yeterli CD-154 blokajı sağlansa da rejeksiyon ortaya çıkıyor CD-154 blokajı Human Renal Allograft Alıcılarında Yapılan Pilot Çalışma Yeterli CD-154 blokajı sağlansa da rejeksiyon ortaya çıkıyor Hastalarda trombotik komplikasyonlar ortaya çıkıyor..Bu yan etki maymunlarda yapılan daha önceki çalışmalarda rapor edilmemiş. Kawai et.al. Nature Med,2000 Kanmaz ve ark. yaptıkları çalışmada NHP renal transplantasyon modelinde akut rejeksiyonu engellemede CD-154 blokajını etkili buluyorlar ama yine tolerans söz konusu değil. Daha önemlisi kullanılan ABI793 bir novel human anti-human CD154 mAb ve bunula da klinik olarak 2 maymunda sessiz trombotik olay saptanıyor. Transplantation, 2004 CD154 platelet yüzeyinde mevcut. Platelet CD154 inhibisyonu platelet plug instabilitesine neden olabilir ve bu durum trombotik olaylara neden olabilir. Trombotik olay nedeni

CD40 Blokajı : NHP çalışma Chimeric anti-human CD40 monoclonal antibody (Chi 220), tek başına veya CTLA4-Ig ile kombine uygulanıyor. Renal allograft model. Chi 220 ile daha uzun (38 güne karşın 7 gün) allograft survi elde edilirken bu durum tolerans oluşturmaktan uzak.. CTLA4-Ig ile kombinasyon daha iyi etkiye sahip değil.. Pearson, Transplantation, 2002

Kombine Donor kemik iliği infüzyonu + CD-154 blokajı NHP’larda yapılan bir çalışma Cosimi et al. Am J Transpl, 2004 Tüm maymunlara i.v. Ketorolac ile profilaksi uygulanıyor CD-154 blokajı ile Donor kemik iliği engraftment ve mixed chimerism oluşumu uzun dönem allograft survi için çok önemli. Donor kemik iliği infüzyonu içermeyen kolda allograft kaybı gelişiyor CD-154 blokajı içermeyen izole kemik iliği içeren kolda allograft kaybı gelişiyor CD-154 blokajı ile daha iyi chimerism ortaya çıkıyor Timik radyasyon uygulaması önemli Ancak geç dönemde 3/8 maymunda kronik rejeksiyon gelişiyor..

NEJM 2005

Belatacept ile Co-stimulasyon Blokajı: Vincenti et al. NEJM,2005

Belatacept ile Co-stimulasyon Blokajı: Vincenti et al. NEJM,2005

2. T cell Deplesyon Total Lenfoid radyasyon Total Lenfoid radyasyon + Kemik iliği infüzyonu Myburg et al., 1980 Baboon’larda TLI+BM infüzyonu 63-100 günlük yaşam süresi Poliklonal Ab (ALG, ATG) ± Kemik iliği infüzyonu Wood, Thomas, 1970 sonları ve 1980’li yıllarda rodent, NHP’larda yaptıkları çalışmalarda sınırlı bir takım olumlu sonuçlar elde ettiler..

2. T cell Deplesyon: anti-CD3 immunotoxin Thomas et al., 3 gün anti-CD3 ve 14 gün deoxyspergualin (DSG) : STEALTH yaklaşımı ile %75 oranında rhesus maymunlarda uzun dönem Renal allograft survi gösterdiler. T cell deplesyonu 6 ay sonrasında düzelmeye başlıyor ancak bunu takip eden rejeksiyon yok. 12 ayda donor spesifik alloreaksiyon ortaya çıkmaya başlıyor. Regülatör mekanizma ? Klinik İnsan Çalışması Henüz Yok 2. Knechtle et al., T cell immunotoxin ile nakil öncesi indüksiyon ile effektör T hücre deplesyonu oluşturmuş ve bu 8/14 NHP da 100 günü Aşan renal graft survi oluşturmuş. 3. ATGAM ve RATG NHP’da genelde daha az etkin T cell deplesyonu oluşturuyor..Genellikle de 21 günde rebound oluşuyor..

T cell Deplesyonu-İnsan Çalışmaları Campath-1H (Alemtuzumab)-Monoklonal Ab-AntiCD52 Window of opportunity for immunologic engagement (WOFIE) hipotezi - Prope tolerans-Almost tolerans protokolleri Calne et al. Campath-1H + low dose cyclosporin monoterapi Lancet, 1998 Knechtle et al. Campath-1H + rapamycin monoterapi AJT, 2003 Cai J et al. Campath-1H + Sirolimus monoterapi Transplantation 2004 Shapiro et al. Campath-1H or Thymo + Tacrolimus monoterapi Ann Surg. 2003

Thymoglobulin kolunda immünsupresyonda azaltılma (gün aşırı veya haftada 3 gün tacrolimus) 1/3 olguda asla yapılamadı Campath-1H kolunda doz redüksiyonu ¼ olguda yapılamadı Diabet, posttransplant lenfoproliferatif hastalık ve infeksiyonlar Campath-1H ve Thymo kolunda konvansiyonel kola nazaran daha az.. Eksiklikler: Kontrollü çalışma değil Tolerojenik protokol olarak adlandırmak doğru değil..

Campath-1H Çok iyi lenfoid deplesyonu yapıyor Uzun etkiye sahip Akut rejeksiyon oranı DGF olan olgularda bile %10 (konvansiyonel Protokollerde bu oran %45) Campath-1H sonrası akut rejeksiyon oluşumu allograftta daha çok monosit-makrofaj birikimi ile gerçekleşmekte Bu hücrelerde bağlanacak Ag yok.. Deoxyspergualin ise monosit makrofaj aracılıklı stimulasyonu bloke eden NHP çalışmalarda etkinliği gösterilmiş bir ajan Her iki ajanın kombinasyonu teorik olarak akla uygun

MM Campath-1H DSG AR IS Kre-2.yıl E 54 Membranöz Canlı 2 -1,1,3,5 -1-12 28 Tac 1.2 E 44 IgA Canlı 3 -1,1,3,5 -1-12 24 Sir 1.5 E 40 Polikistik BH Canlı 4 -1,1,3,5 12-25 32 Sir 2.1 K 29 Meduller KH Canlı 1 -1,1,3,5 12-25 29 Tac 1.8 K 28 Obstrük.Nef. Canlı 3 -1,1,3,5 12-25 26 Sir 2.0 Transplantation, 2005

Bu çalışmada: Tolerans oluşumu sağlanamadı DSG ile ek avantaj ortaya konamadı

Combination Immunosuppressive Therapy to Prevent Kidney Transplant Rejection in Adults Sponsor: ITN, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) Knetchle et al. 10 hasta 0,1,2. günler 30 mg Campath1-H 2 ay tacrolimus 1 yıl Sirolimus IS stop

3. Donor KI infüzyonu-Mixed Kimerizm - Makrokimerizm - Mikrokimerizm 1950’lerden beri NHP’da ve İnsanlarda uygulanan bir yöntem İndüksiyon Donor KI infüzyonu Myeloablasyon Makrokimerizm Non-myeloablatif rejimler Mikrokimerizm GVHD ?

Regulator lenfositler Matur Lenfositler Donor KI veya PSC İnfüzyonu ve timik engraftment İmmatur lenfositler Santral mekanizma Antijen spesifik lenfositlerin delesyonu (Apoptozis) Thymus Periferik mekanizma Regulator lenfositler Matur Lenfositler Co-stimulatör blokaj Ve T cell deplesyonu Anerji Delesyon (Apoptozis) Dalak ve Lenf nodlari

KI Tx + Solit Organ Tx İlk olarak 15 yıl önce hematolojik malignite nedeni ile AlloBMT yapılan olgularda renal yetmezlik gelişince aynı donorlerden böbrek nakli gerçekleştiriliyor. Olgularda uzun dönem tolerans oluşumu bir çok olgu sunumunda bildiriliyor Sayegh Ann Int Med, 1991 Sellers MT, Transplantation,2001 Jakobsen N, Lancet, 1994 Butcher JA, Clin Transplant, 1999

Mixed Kimerizm-NHP 4 Cynomolgus Maymun ATG, TBI (300 rads) TI (700 rads) Kawai et al.,Transplantation, 2005 Donor KI Infüzyonu Uzun süreli Graft Fonksiyonu Aynı grup 1999’da bu protokole Splenektomi’yi eklediklerinde anti-donor Ab oluşumunun engellendiği, B hücre toleransı için splenektominin gerekliliğini ortaya koydular

Mixed Kimerizm ve anti-CD154 kombinasyonu: NHP Kawai et al., non-myeloablatif rejim ile birlikte KI infüzyonu ve Anti-CD154 blokajı ile uzun süre allograft fonksiyonu Daha iyi mikrokimerizm Problem Mikrokimerizm geçici Uzun dönemde kronik rejeksiyon gelişimi var Uygulanan protokol modifiye edilmeli AJT,2004

Donor KI infüzyonu-Uzun dönem Allograft Fonksiyonu

Donor HSC infüzyonu-İnsan Çalışmaları Trivedi HL, Vanikar AV, Vakil JM, Shah VR, Modi PR, Trivedi VB. A strategy to achieve donor-specific hyporesponsiveness in cadaver renal allograft recipients by donor haematopoietic stem cell transplantation into the thymus and periphery. Nephrol Dial Transplant. 2004 Sep;19(9):2374-7. Trivedi HL, Shah VR, Vanikar AV, Gera D, Shah PR, Trivedi VB, Khemchandani S, Mehta A, Dalal SS, Shah SA, Shah TP, Visana KV. High-dose peripheral blood stem cell infusion: a strategy to induce donor-specific hyporesponsiveness to allografts in pediatric renal transplant recipients. Pediatr Transplant. 2002 Feb;6(1):63-8.

Donor KI veya PSC infüzyonu Sensitizasyon korkusu Kimerizm oluşumu ile tolerans oluşumu arasında net bir birliktelik yok Kimerizm kısa süreli ve uzun dönemde tamamen kaybolabilmekte Kimerizm kaybolsa dahi allograft fonksiyonu normal kalabilmekte Kimerizm olsa dahi anti-donor Ab yoğun olarak oluşabilmekte Ciddi myeloablasyon GVHD oluşturabilir.. Pratik uygulama konusunda sıkıntılar.. Graft survi üzerine ve rejeksiyona olumlu etkiden söz edilse de ne immunsupresyon kesilmesi ne de tolerans için kimerizm yeterli bir gösterge değil.. (Shapiro et al., AnnSurg, 2003, Monaco ve Medawar, Transplantation,2003)

Regülatör T hücreleri Thymus TR Foxp3+ TGF-Beta TE Self-yabancı Ag Th0 Contact dependent supression IL-10/TGF-B TGF-Beta TE Self-yabancı Ag Cytokine ve/veya contact depend. Suppression IL-10/TGF-B Th0 Tr1 Th3 Foxp3- Naive T cells Fehervari Z, 2005 Phil Trans R Soc

Regülatör T hücreleri; Major Sorunlar CD4+CD25+ Treg hücreler için yeterli tanımlayıcı mı? - Spesifik değil - Tüm aktive T hücreleri geçici süre CD25+ olabilmekte Transcription faktör foxp3 son dönemde Treg hücreler için önemli moleküler belirleyici olarak belirlenmiştir. CD4+CD25+ hücreler ile allograft fonksiyonu arasında insanlarda yapılan çalışmalarda farklı sonuçlar.. Game DS, Hernandez-Fuentes MP, Chaudhry AN, Lechler RI. CD4+CD25+ regulatory T cells do not significantly contribute to direct pathway hyporesponsiveness in stable renal transplant patients. J Am Soc Nephrol 2003; 14: 1652. Calcineurin Inhibitors, but not Rapamycin, Reduce Percentages of CD4+CD25+FOXP3+ Regulatory T Cells in Renal Transplant Recipients. Segundo DS, Transplantation 2006,

Ne kadar CD4+CD25+foxp3+ hücreye gerek var Regülatör T hücreleri; Major Sorunlar Ne kadar CD4+CD25+foxp3+ hücreye gerek var Yeterli Treg hücre oluşturulduğunda immünosupresyon kesilmeli Monitorizasyon problemi Treg kesin etki mekanizması nedir? Foxp3 gen viral vektör ile T hücrelerine aktarılabilmekte (Retrovirus-Fare) insanda bu işlem??

ELISPOT: Aktive veya memory T hücrelerinin varlığını gösteren test. Trans vivo Delayed Type Hypersensitivity TcLandscape Dentritic cell subset analysis T cell fenotype Gen polimorfizmleri Urine Proteomics Anti-donor Ab düzeylerinin takibi

SONUÇ Transplantasyonda immüntoleransa giden yol oldukça uzun ve zorlu İnsan çalışmaları yetersiz Çözümlenmemiş bir çok sorun var Organ transplantasyon başarılı bir uygulama olsa da henüz mükemmel yaklaşım arayışları devam etmekte..