Prospectıve evaluation of a novel multiplex real time PCR assay for detection of fifteen respiratory pathogens- Duration of symptoms significantly affects detection rate Robin Brittain-Long, Johan Westin, Sigvard Olofsson, Magnus Lindh, Lars-Magnus Andersson SWEDEN Journal of Clinical Virology 47 (2010) 263–267

15 RESPİRATUVAR PATOJENİN MULTIPLEKS PCR YÖNTEMİYLE TESBİTİ VE HASTALIĞIN SEMPTOMLARININ SÜRESİNİN TESPİT ORANINA ETKİSİ Araş.Gör.Dr.Oya AKKAYA Prof.Dr.Bülent BAYSAL

GİRİŞ Viral solunum yolu infeksiyonlarının tanısı için hızla real-time PCR teknikleri gelişmektedir. PCR’ ın –yüksek duyarlıklı olması –kısa zamanda tanı koyması –tek örnekte birkaç patojeni tespit edebilmesi en önemli avantajlarındandır.

Konvansiyonel yöntemlerle varlığı gösterilemeyen rinovirus,koronavirüs, metapnömovirus gibi solunum sistemi virusleri PCR ile gösterilebilir Hastaneye yatan solunum yolu infeksiyonlu erişkinlerin sadece %15’inde viral respiratuvar ajanların rol aldığı gösterilmiştir Şiddetli pnömoni, YBÜ’nde yatan hastalar ve bronko- alveoler lavaj kültürleri negatif olan hastaların %63’ünde ise virüsler gösterilmiştir

Viruslerin hafif üst solunum infeksiyonlarına yol açtığına inanılırken şiddetli alt solunum yolu infeksiyonlarından da izole edilmiştir. Moleküler yöntemlerin sensitivitesi, klinik bulguların evresiyle orantılı olarak değişir Respiratuvar sistem örneklerinde viral ajanların PCR ile tespiti hızlı ve sensitivdir Tanı koymada konvansiyonel metodların yerini hızla almaktadır

ÇALIŞMA DÜZENİ Bu çalışma Batı İsveç’te 2006 – 2008 yıllarında Ekim- Nisan ayları arasında toplanan hastalarla yapılmıştır Bu çalışmaya 18 yaş üzeri ve semptomları 2 haftadan daha az zamandır devam eden hastalar alınmıştır

Semptomlar Burun akıntısı Burun tıkanıklığı Hapşırık Boğaz ağrısı Yutma güçlüğü Öksürük Göğüs ağrısı Nefes darlığı Ateş

Bu semptomlardan en az ikisinin varlığı çalışmaya alınmaya yetmiştir Bakteriyel infeksiyon tanısı alan hastalar çalışmaya alınmamıştır Hastalar muayene edilmiş, sonra 10 gün içinde tekrar muayeneye çağrılmıştır Bulgular ve semptomlar her iki ziyarette de kaydedilmiştir Ateşi ve solunum sistemi şikayeti olmayan 100 sağlıklı erişkin de kontrol grubu olarak alınmış –bu kontrol grubu testten 2 gün sonra aranmış ve herhangi bir solunum sistemi bulgusu olup olmadığı sorulmuş, olanlar çalışma dışına alınmıştır

Her hastadan ve kontrol grubundan nasofarengiyal ve boğaz sürüntüsü almak için uygun swablar kullanılmış ve bu swablar daha sonra 1 ml sodyum klorid içinde steril bir şekilde aynı gün viroloji laboratuvarına gönderilmiştir Laboratuvarda ise -70 derecede saklanmıştır

Nükleik asit ekstraksiyonu ve RT-PC Bu çalışmada otomatize örnek ekstraksiyonu ve multipleks amplifikasyon yapılmış 15 respiratuvar virüs primeri kullanılarak örneklerdeki virüsler tanımlanmıştır

Bu virüsler Parainfluenza 1-3 İnfluenza A-B Human MPV RSV Rinovirüs Enterovirüs Adenovirüs Coronavirüs 229E-OC 43-NL 63 Mycoplasma pneumoniae Chlamydia pneumoniae

SONUÇLAR: Bu çalışmada 219 tane üst solunum yolu infeksiyonu semptomları olan hasta ve 100 tane asemptomatik kontrol grubu kullanıldı 94 hastadan(yani %43’nden) ve 2 kontrol hastasından infeksiyöz ajanlar identifiye edildi Hiçbir hasta grubunda Enterovirüs veya klamidya pnömoniae tespit edilemedi Pozitif hastaların %7’sinde tek 1 tane ajan identifiye edildi

BELİRTİLERİN SÜRESİ Semptomlar 0-14 gün arasında sürmüştür Çalışmaya alınan hastaların çoğu ilk 7 gün içindedir Tespitlerin %51’i ilk 6 gün içinde, %30’ u 6-14 gün içindedir Ama semptomların ilk 6 günü içinde virüs tespit hızı daha yüksektir

VİRAL YÜK Koronavirüs, influenza A ve B için semptomların süresi ile PCR cycle threshold(ct-values)değerleri uyumluydu Yani semptomların ilk günlerinde viral yük fazlaydı Ama rinovirüs için bu uyum yoktu

TESTLERİN TAKİBİ Hastaların 138 ‘i(%63’ü) 2. muayene için ilk muayeneden 10 gün sonra geri geldi Nasofaringeal ve boğaz sürüntüsü örnekleri tekrar alındı İlk muayenede 94 hastanın PCR sonuçları pozitif çıktı 57 hasta ise 2. muayenede pozitif çıktı 18 hastanın PCR sonuçları hem 1. hem de 2. muayenede pozitif çıktı –13 hastada ilk muayene ve 2. muayenede etken aynı virüs çıktı – 5 hastada ise 2. muayenede farklı virüs çıktı Aynı virüsle 2. defa infekte çıkınca viral yük daha düşüktü

Bu 13 kişiden – 8’inde rinovirüs –2’sinde koronavirüs NL63 –1’inde koronavirüs OC43 –1’inde mycoplasma pneumoniae –1’inde RSV etken olarak belirlendi

TARTIŞMA Bu çalışmaya immün sistemi iyi olan ve solunum yolu infeksiyonu geçirmekte olan hastalar alınmıştır Semptomların başlamasından itibaren ilk 6 gün içinde boğaz sürüntüsü alınmış ve multipleks PCR yapılmıştır Sonuçlar tek bir virüs araştıran PCR yöntemleriyle uyumlu çıkmıştır

Hastaların %43’ ünde viral bir ajan tespit edilmiştir Asemptomatik olup viral yükü yüksek olan çocuklar rapor edilmiştir İmmun sistem bozukluğu olan ve çok miktarda virüs almış olan çocuklarda replikasyon hızı ve virüsün vücutta kalış süresi yüksektir Ayrıca çocuklarda immun sistem yetişkinden daha immatür olduğundan virüsün vücutta kalış süresi uzundur ve vücutta döküntü olur Bu nedenle daha önceki çalışmalarda çocuklarda virüs tespit etme oranı daha yüksektir

Erişkin populasyonda virüsün tespit oranı düşüktür Ayrıca çalışma grip mevsiminde yapıldığı için influenza A ve B oranı diğer virüslerden yüksektir Kontrol grubunda sadece %2’lik bir kısmında rinovirüs tespit edilmiştir Rinovirüs,RSV ve parainfluenza virüsün tespit edildiği immün kompromize hastalarda asemptomatik deri döküntüsü görülmüştür Ama döküntüler 14 günü geçmemiştir

Birkaç virüsün, hastalığın semptomları boyunca viral yükünün basamak basamak azaldığı görülmüştür Aynı hastada birkaç virüsün aynı anda tanımlandığı görülmüştür Bu durum genç hastalarda görülmüştür Birden çok virüsün etken olduğu hastalıklarda klinik daha ağırdır Daha yüksek ateş, daha uzun hastanede yatış süresi ve daha sık antibiyotik kullanımı tespit edilmiştir

Bu çalışmada koronavirüs, influenza A ve B’ nin semptomları ve viral yükleri arasında bir uyum bulunmuştur Rinovirüs için böyle bir uyum gösterilememiştir –Bu durum rinovirüsün yüksek genetik değişkenliğiyle açıklanabilir

Hastaların %62 gibi bir çoğunluğunda yani 13 kişide, hem 1. muayenede hem 2. muayenede test pozitif çıkmıştır Bunlardan 8’inde etken rinovirüstür PCR’daki viral yükle hastalığın kliniği arasındaki ilişki tam kurulamamıştır İnfluenza A ve B gibi bazı virüslerde testin pozitif çıkması antiviral tedavi için önemlidir çünkü hasta antiviral tedaviden faydalanabilir gereksiz antibiyotik reçetelenmesi de böylece önlenebilir

Çalışmanın sonucunda semptomların süresiyle virüsün tespit edilme oranı (yani viral yükü) arasında bir ilişki olduğu sonucuna varılmıştır Virüsleri tespit ederken PCR testleri kullanılacaksa hastalığın semptomlarının süresi (yani hangi aşamada olduğu) hesaba katılmalıdır