In vitro DNA AMPLİFİKASYONU PCR Elektroforezis Doç.Dr.Öztürk ÖZDEMİR

In vitro DNA Amplifikasyonu 1- Moleküler klonlama, DNA parçalarının, bakteri gibi basit yapılı organizmalarda çoğaltılmasıdır. Bu yöntemde çoğaltılacak hedef DNA, vektör adı verilen ekstra kromozomal DNA molekülüne (plazmid) transfer edilir. Oluşan rekombinant plazmid ise uygun bir bakteri hücresine sokularak bakterinin çoğaltılmasıyla in vivo olarak amplifiye edilmiş olur

POLYMERASE CHAIN REACTION - PCR 2. DNA’nın çoğaltılabileceği bir teknik, 1983 de Kary Mullis adlı bir biyokimyacının geliştirdiği Polimeraz Zincir Reaksiyonu’dur. İlk kez başarılı in virto DNA amplifikasyonu Saiki ve ark. Tarafından 1985 yılında gerçekleştirildi. http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/mullis-autobio.html Kary Mullis c1983

Amplifikasyon yöntemlerinin gelişmesinde iki önemli nokta termofilik Thermus aquaticus ‘tan ısıya stabil DNA polimeraz bilgisayar kontrollü termal döngü cihazlarının geliştirilmesi

PCR’nun Kullanıldığı Alanlar PCR’nin geliştirilmesi, moleküler biyoteknolojinin ve kullanım alanının da genişlemesine yol açmıştır Moleküler biyoloji ve biomedikal araştırmalar Bakteriyel, viral, fungal ve protozoal hastalık etkenlerinin teşhisi Gıda, su ve yiyeceklerde bulunan mikroorganizmaların tanısı Genetik bozukluklar ve kanser taramaları

Prenetal tanı ve cinsiyet belirlenmesi Gen tedavisi ve DNA aşıları Adli tıp’da suçlu teşhisi Antropoloji

PCR’nun Çalışma Prensibi · PCR küçük volumlar halinde hazırlanır (0.5 ml’lik mikrofüj tüpüne, 100 ml hacminde materyal konur)

1- Hedef diziyi taşıyan kalıp DNA · PCR için gerekli malzemeler: 1- Hedef diziyi taşıyan kalıp DNA (az miktarda ve ilgisiz DNA’larla kontaminasyon sorun değildir) 2- Kalıp DNA çift iplikleri ile eşleşebilen 2 tür oligonükleotid primeri (15-30 bazlık ve tek iplikli) 3- Dört tür dNTP (dATP,dCTP,dGTP,dTTP) 4- Termostabil DNA polimeraz enzimi (Taq, Vent)

· Bu materyaller bir tampon çözeltisi içinde karıştırılır. MgCl2 gereklidir. · Thermal Cycler adı verilen özel bir cihaz kullanılarak DNA’nın amplifikasyonu gerçekleştirilir. Bu cihaz, PCR örneğini programlanan ısı derecelerinde ve istenilen sürelerde tutmaya yarar.

· Her bir PCR döngüsü üç aşamada gerçekleştirilir. 1- Hedef DNA’nın denatürasyonu (95 oC de 5 dak.) ds DNA’ nın birkaç saniyede ısı ile ss DNA’ ya ayrılmasıdır. (döngüye başlamadan 3-5 dk ön ısıtma yapılabilir) 2- Primerlerin bağlanması (42-52 oC de 5 dak.) örnek 1-2dk bu ısıda tutularak primerlerin (spesifik sentetik oligonükleotitler) ss DNA’ daki hedef bölgelere hibridizasyonu sağlanır. 3- Polimerizasyon (65-72 oC de 5 dak.) polimeraz enzimi yardımı ile ss DNA kalıplarına bağlanan primerlerin 5’ 3’ yönde uzatılmasıdır. · Her döngüde elde edilen yeni DNA’lar bir sonraki için kalıp görevi gördüklerinden, 25-30 döngü sonunda, DNA’nın milyonlarca kopyası elde edilir.

Taq DNA polimeraz optimal uzama sırasında yani 72-78 °C arasında 2000 nükleotid/dakika hızında çalışır.

Polymerase Chain Reaction In vitro DNA (gene) amplifikasyon tekniği 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ DNA >90°

Polymerase Chain Reaction 5’ 3’ 40–60°

Polymerase Chain Reaction 5’ 3’ 72°

Polymerase Chain Reaction 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 72° 40–60° >90°

Polymerase Chain Reaction 5’ 3’ 72° 40–60° >90°

Polymerase Chain Reaction 72° 40–60° >90°

Polymerase Chain Reaction 2n x

PCR: 3 steps

PCR’nun Avantajları · Çabuk · Duyarlı · Yüksek özgüllüğe sahip

PCR’nun Dezavantajları · Pahalı · Kros reaksiyonlar/non-spesifik DNA amplifikasyonu  Sterilite · Yalancı pozitif/negatif değerlendirme  Deneyimli personel

Her teknikte olduğu gibi PCR’da da optimizasyon şarttır. Yüksek özgüllüğü ve duyarlılığına rağmen; · düşük ürün miktarı · primerlerden kaynaklanabilen non-spesifik ürün eldesi · kontaminasyon sonucu yalancı pozitif sonuçlar gibi sorunlar yaşanabilmektedir. İyi bir teknik kadro ve pozitif/negatif kontroller kullanılarak bu sorunlar giderildiği taktirde PCR, biyoteknologların hayatını kolaylaştıran bir tekniktir.

PCR ile Saptanan Bakteriyel Patojenler Bacillus antracis Corynebacterium diphtheriae Shigella sp Vibrio cholerae Mycobacterium avium Mycobacterium tuberculosis

PCR ile Saptanan Viral Patojenler Hepititis A,B,C,E,G İnsan papillomavirus HIV-I,II Influenza virus Rubella virus Herpes simplex virus

PCR ile Saptanan Fungal Patojenler Blastomyces dermatitis Histoplasma capsulatum Candida albicans Pneumocyctis carinii

PCR ile Saptanan Protozoal Patojenler Plasmodium falciparum Leishmania sp Toxoplasma gondii Trypanosoma sp.

Amplifikasyon Ürünlerinin Tespit Edilmesi PCR ile amplifiye edilen DNA’yı tespit etmenin bir yolu : Elektroforez

Elektroforez prensibi Cathode Anode powder + ion

DNA proteinler ve birçok biyomoleküller gibi elektriksel yük taşır. DNA negatif yüklüdür.Bu nedenle anoda doğru hareket eder.Yükleme katod tarafına yapılmalıdır. DNA molekülleri şekilsel ve elektrik yükü bakımından benzer olduğundan elektroforez kriterlerine göre ayrılmaz DNA molekülleri büyüklüklerine göre ancak bir jel içinde ayrılabilirler.

DNA molekülleri genellikle agaroz ya da poliakrilamid jel içinde elektroforez edilir. Jellerin içerisinde DNA moleküllerinin girip hareket edebilecekleri porlar vardır. Elektroforez ile ayrılan DNA’ yı görmek için ise etidyum bromid ile boyanır.(UV boya)

PCR - analizi Jel-elektroforez

PCR: Viral detection

Tüm Aşamaları Özetleyecek Olursak

Ürinlerin değerlendirilmesi Thermal Cycler Elektroforez 3-4 hours Ürinlerin değerlendirilmesi (Agaroz jel) UV translüminatör