T.C ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ ZİRAAT FAKÜLTESİ REAL-TİME PCR İLKER TOKLUCU MEHMET HAN BAŞTÜRK TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ BÖLÜMÜ    2019-SAMSUN  

Real-Time PCR (Gerçek zamanlı PCR) Real-Time PCR floresan boyalar kullanılarak gerçek zamanlı olarak DNA’nın belirlenmesi ve miktarının gösterilmesi tekniğidir. Sonuçlar PCR analizi sırasında elde edilebilmektedir. Gen anlatımının analizini değiştiren bu metot ile geleneksel PCR yöntemi ve gen analizi birleştirilmiştir. 1

PCR çoğaltımını görünür hale getiren ve monitorize edebilen floresan işaretli prob ve boyaların kullanıldığı, floresanın oluşan DNA ile doğru orantılı olarak arttığı bir çoğaltma yöntemidir. Yabancı yayınlarda kinetik PCR, homojen PCR, kantitatif Real-time PCR gibi çeşitli adlarla da isimlendirilmektedir. 2

Özgül Olmayan Belirleme Sistemi Real-time PCR’da amplifikasyon sonrasında elde edilen ürün varlığının saptanması çeşitli şekillerde yapılabilir. Bunlardan birincisi özgül olmayan bir yöntem olan çift zincirli DNA boyalarının kullanılmasıdır. Bu amaçla en çok kullanılan boya SYBR Green I’dır. 3

SYBR Green I Yöntemi Bu yöntemde kullanılan floresan boya sadece çift zincirli DNA’ya bağlandığından çoğalan DNA miktarındaki artışa paralel olarak Real-time PCR cihazında okunan floresanın miktarı da eş zamanlı olarak artar. 4

Bağlı olmayan serbest DNA molekülü çok az bir floresan ışıma yapar. Primerler bağlanıp uzama başladığında boya molekülü çift zincirli DNA’nın arasına girer ve floresan yayılımı başlar. 5

SYBR Green I Yönteminin Dezavantajları İstenmeyen PCR ürünlerin çoğalması ile yine floresan açığa çıkacağından her zaman istediğimiz DNA’nın çoğaldığını işaret etmez, yanlış pozitif sonuç almak mümkündür. Çoğaltılan DNA’nın istenilen hedef bölge olup olmadığını anlayabilmek için DNA’ların erime eğrisi analizleri yapılması gerekmektedir. 6

Özgül Belirleme Sistemi DNA parçasının çoğaltılmak istenilen bölgesi özel bir bölge ise bu bölgenin saptanmasında floresan işaretli problar kullanılır. 7

1.TaqMan Prob Yöntemi TaqMan sisteminde 5’ ve 3’ uçlarından florokrom maddelerle işaretli prob kullanılmaktadır. TaqMan prob yöntemi çoğaltılmak istenilen DNA’ya komplementer olan ve floresan işaretlenmiş tek zincirli bir prob içerir. 8

2.Moleküler Boncuk Yöntemi Moleküler boncuk probu solüsyon içerisinde serbest halde iken ışıma yapmaz. Çoğaltılmak istenen DNA bölgesi PCR ile çoğalmaya başladığında prob hedef DNA dizisine göre dizayn edildiğinden birbirleri ile karşılaştıklarında konformasyonu değişir ve düz, çift zincirli hale geçer. 9

3.Hibridizasyon Prob Yöntemi Bu yöntemde iki farklı prob dizayn edilmiştir. 3’ ucunda floresan işaretli boya (donor), 5’ ucunda alıcı boya (acceptor) bulunmaktadır. PCR reaksiyonu sırasında bu iki prob hedef nükleik asit dizisine bağlanıp birbirine yaklaştığında bir enerji yayılımı olur. Enerji donor boyadan acceptor boyaya transfer olur. Bu enerji transferi sonucunda oluşan floresan miktarı PCR süresince oluşan ürün miktarı ile doğru orantılı olarak artar. 10

Real-Time PCR’ın Avantajları Eş zamanlı olarak sonuç alınabilmesi Hızlı sonuç alınması, Kontaminasyon riskinin çok az olması, Nicel ve nitel olarak sonuç alınabilmesi, Non spesifik bir bağlanma olmaması, Sonuç almak için ikinci bir tekniğe ihtiyaç duyulmaması. 11

Real-Time PCR’ın Dezavantajları Kullanılan malzemenin pahalı olması, Sadece bilinen mutasyonları tanıması, Protokol oluşturmak için çok gelişmiş bir sisteme ihtiyaç duyulmasıdır. 12

Real-Time PCR’ın Kullanım Alanları Virüs varlığının ve miktarının belirlenmesi, Patojen saptanması, SNP varlığının belirlenmesi, DNA hasar tespiti, Kromozomlardaki sayısal, yapısal bozuklukların analizi, RNA çalışmaları, Metilasyon tespiti. 13

ÖRNEK SORULAR REAL-TİME PCR’DA KULLANILAN SYBR GREEN I BOYAMA YÖNTEMİNİN DEZAVANTAJLARI NELERDİR? İstenmeyen PCR ürünlerin çoğalması ile yine floresan açığa çıkacağından her zaman istediğimiz DNA’nın çoğaldığını işaret etmez, yanlış pozitif sonuç almak mümkündür. Çoğaltılan DNA’nın istenilen hedef bölge olup olmadığını anlayabilmek için DNA’ların erime eğrisi analizleri yapılması gerekmektedir.

2. REAL-TİME PCR’IN KULLANIM ALANLARINI NELERDİR ? Virüs varlığının ve miktarının belirlenmesi, Patojen saptanması, SNP varlığının belirlenmesi, DNA hasar tespiti, Kromozomlardaki sayısal, yapısal bozuklukların analizi, RNA çalışmaları, Metilasyon tespiti.

2.Moleküler Boncuk Yöntemi 3.Hibridizasyon Prob Yöntemi 3. ÖZGÜL BELİRLEME SİSTEMİ KAÇA AYRILIR BİRİNİ AÇIKLAYINIZ. 1.TaqMan Prob Yöntemi 2.Moleküler Boncuk Yöntemi 3.Hibridizasyon Prob Yöntemi TaqMan PROB YÖNTEMİ: TaqMan sisteminde 5’ ve 3’ uçlarından florokrom maddelerle işaretli prob kullanılmaktadır. TaqMan prob yöntemi çoğaltılmak istenilen DNA’ya komplementer olan ve floresan işaretlenmiş tek zincirli bir prob içerir.