DNA İZOLASYONU VE SAFLAŞTIRILMASI

Slides:



Advertisements
Benzer bir sunumlar
NVA KALİTE TEST ÖLÇ. HİZ. EĞT. VE BELG. SAN.TİC. LTD. ŞTİ. Hazırlayan= E. Burak SARAÇOĞLU.
Advertisements

ANLATIM TÜRLERİNİ SINIFLANDIRMA. Edebî türler veya metin türleri olarak bilinen yazılarda farklı anlatım birlikleri bir araya gelir. Bir hikâyede betimleme,
TOPRAĞIN HİKAYESİ HORİZON: Toprağı meydana getiren katmanlara horizon adı verilir. TOPRAK: Toprak taşların parçalanması ve ayrışmasıyla meydana gelen,
Kompozitler Farklı malzemelerin üstün özelliklerini aynı malzemede toplamak amacıyla iki veya daha fazla ana malzeme grubuna ait malzemelerin bir araya.
PROTEİNLERDEKİ AMİNO ASİT BİLEŞİMİNİN BELİRLENMESİ
Entegre Savaş Zararlı ve hastalık etmenlerine karşı kullanılan çeşitli yöntemlerin birbirini tamamlayıcı, ekosistemdeki dengeyi koruyucu şekilde uygulanmaları...
Hat Dengeleme.
Bilimsel bilgi Diğer bilgi türlerinden farklı
MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II:
Arş.Gör.İrfan DOĞAN.  Bugün otizm tedavisinde en önemli yaklaşım, özel eğitim ve davranış tedavileridir.  Tedavi planı kişiden kişiye değişmektedir,
karIşImlarIn ayrIlmasI
Hazırlayan: Musa Yıldız Hazırlayan: Musa Yıldız Erciyes Üniversitesi Biyoloji Bölümü Erciyes Üniversitesi Biyoloji Bölümü.
MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II:
(YÖNETİCİ MOLEKÜLLER= ÇEKİRDEK ASİTLERİ= DNA ve RNA)
Arasınav ders ve temaları. Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı , Bahar, Trakya Üniv Tıp Fak 6. Kurul, Neşe Akış, PhD, Tıbbi Mikrobiyoloji.
Aktif Karbon Adsorpsiyonuyla Ağır Metal Giderimi ve Alevli AAS ile Tayin PEKER S1, KAŞ M.1, BAYTAK S.1  1Süleyman.
SU İTİCİ APRE TUĞBA DÜZAL.
PROTEİN TAYİN YÖNTEMLERİ BRADFORD YÖNTEMİ
CANLILIK ve ENERJİ
Hİjyenİk El YIkama Normal sabunlar ve antiseptik özellikli sabunlar kullanılabilir. Bu şekilde geçici mikroorganizmalar uzaklaştırılır ya da öldürülür.
DNA’nın İzolasyonu ve Analizi
portali.com NÜKLEİK ASİTLER DNA portali.com.
FNP GRUBU: fatma ışık, nagehan öztürk, pınar sevindik
ÇÖZELTİLER VE ÇÖZÜNÜRLÜK
DENEYSEL TERTİPLER VE PAZAR DENEMESİ
İMAL USULLERİ PLASTİK ŞEKİL VERME
GÜÇ TUTUŞURLUK VE BURUŞMAZLIK APRELERİ
C Elementi.
Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı
Ksenobiyotiklerin Biyoremediasyonu
PİGMENT BOYARMADDELERLE BASKI YAPMA
Biyoremediasyon Oranını Etkileyen Faktörler
4. GRUP KATYONLAR (Ba+2, Ca+2, Sr+2).
GENİN TEMEL FONKSİYONLARI: 2. TRANSKRİPSİYON
Faj Vektörler 8-25 kb arası fragmentleri etkin olarak taşıyabilirler
Gen Mühendisliği ve Veteriner Hekimlikte Biyoteknoloji
Cam Membran İyon Seçici Elektrotlar
Maddenin Ayırt Edici Özellikleri
5.Konu: Kimyasal Tepkimeler.
6. SAF MADDE VE KARIŞIMLAR
Atomlar birleştiği zaman elektron dağılımındaki değişmelerin bir sonucu olarak kimyasal bağlar meydana gelir. Üç çeşit temel bağ vardır:
Çözünürlük Çarpımı (Kçç)
Kalıtsal madde (kalıtsal molekül, genetik materyal)
MADDENİN DEĞİŞİMİ VE TANINMASI
Yatay Gen Transferinin Hesaplanması
Biyoinformatik.
BÖLÜM 7 SIVILAR VE GAZLAR. BÖLÜM 7 SIVILAR VE GAZLAR.
Biyokimyasal Ölçüm Teknikleri
6.SAF MADDE VE KARIŞIMLAR
 Plazmidler bakterilerde bulunan, ekstra kromozomal, çift iplikli, dairesel DNA molekülleridirler.  Hücre içerisinde boyutları ve kopya sayıları çeşitlilik.
SOLUNUM.
MADDENİN AYIRTEDİCİ ÖZELLİKLERİ
Maddeler doğada karışık halde bulunur
Bitkisel Kökenli İlaç: Aspirin
TEKNOLOJİ VE TASARIM DERSİ 7.D.1. Özgün Ürünümü Tasarlıyorum.
Enzimatik Ölçümler (Pratik Ders)
Hücrelerin ve embriyoların farklı kryoprezervasyon yöntemleriyle ve değişik protokollerle saklama çalışmaları 40 yıldan fazladır sürdürülmektedir. Bu kryoprezervasyon.
Bu maddelerin çoğunun nispeten sadece küçük bir kısmı farmasötik örneklerin (ilaç formülasyonlarının) hazırlanmasında kullanılır: çoğu gıda ve kozmetik.
Problemler – Kültür Sırasında Problemler
Oyun İçine Gömülü Öğretim
MİKROORGANİZMALARIN İNVİTRO ÜREME GÖRÜNÜMÜ
KATI KRİSTALLER. KATI KRİSTALLER KATILARIN ÖZELLİK VE YAPILARI.
Canlıların Büyüme ve Yaşamasına Etki Eden Faktörler
Biyoteknoloji İçin Mikrobiyoloji 1
FOTOSENTEZ.
Veri ve Türleri Araştırma amacına uygun gözlenen ve kaydedilen değişken ya da değişkenlere veri denir. Olgusal Veriler Yargısal Veriler.
METABOLİZMA Yrd. Doç. Dr. Musa KAR.
KARIK SULAMA YÖNTEMİ Prof. Dr. A. Halim ORTA.
TYS102 ÖLÇME BİLGİSİ Yrd. Doç. Dr. N. Yasemin EMEKLİ
Bilimsel Araştırma Yöntemleri
Sunum transkripti:

DNA İZOLASYONU VE SAFLAŞTIRILMASI

DNA DNA hücrede serbest bir molekül halinde değildir DNA’nın fonksiyonuna bağlı olarak regülatör proteinler (histonlar, histon olmayan proteinler), DNA ve RNA polimerazlar, DNA ligazlar, kombinasyon ve onarımla ilgili diğer enzimler ve RNA ile bir kompleks halinde bulunur Virüslerde bir protein kılıf içinde yer alır.

DNA’nın İzolasyonu Hücre duvarının parçalanması DNA-protein kompleksinin çözülmesi (denatürasyon veya proteoliz) DNA’nın ortamdaki diğer moleküllerden ayrılması

Hücre Duvarının Parçalanması İlk aşama duvarın zayıflatılmasıdır Fiziksel olarak (dondurma-çözme) ya da kimyasal maddeler (lizozim, EDTA vb) uygulayarak yapılır. Tam parçalama işleminde ise iyonik (SDS) veya iyonik olmayan (Triton-100) deterjanlar kullanılır Parçalama işleminde izlenecek yöntem DNA boyutuna ve kullanılan organizmaya bağlıdır

DNA’nın Ortamdaki Diğer Moleküllerden Ayrılması Genom DNA’sı açık halkasal bir yapı göstermesine karşılık plasmid DNA’sı süper sarmal yapıdadır (covalently closed circular (ccc) DNA) Yüksek bazik ortamda (pH 12-12.5) farklı reaksiyon verir DNA’nın diğer moleküllerden ayrılması için DNA kimyasal ve fiziksel etkilere maruz bırakılır DNA kimyasal olarak (etanol, izopropanol) çöktürülebilir Fiziksel uygulamada santrifüjleme hızı ayrılması istenen molekülün ağırlığına göre değişkenlik gösterir

DNA-Protein Kompleksinin Çözülmesi Denatürasyona dayanan bu yöntemde çoğunlukla fenol ekstraksiyonu işlemi kullanılır Fenolle proteinler ve DNA fragmentleri denatüre edilerek ortamdan uzaklaştırılmaları sağlanır

DNA’nın Saflaştırılması Ortamda doğrusal ve süper sarmal yapı gösteren DNA’lar mevcutsa bunların ayrılması içerdikleri etidyum bromür (EB) miktarına bağlıdır. Etidyum bromür DNA’ya bazlar arasına girerek bağlanır ve çift sarmalın çözülmesine neden olur. Bu durum doğrusal DNA molekülünün boyunun uzamasına ve plasmidlerde süper sarmal dönümlerin oluşmasına neden olur. Süper sarmal dönümlerin yoğunluğundaki artışla EB girişi engellenir. Doğrusal DNA molekülü doygunluğa erişinceye kadar EB almaya devam eder EB değişik oranda bağlanması sonucu oluşan yoğunluk farkı bu iki molekülün farklı çökelmesine neden olur DNA’nın saflaştırılması için CsCl-etidyum bromür gradienti denge santrifüjlemesi kullanılır

Sezyum klorid derecelenme santrifüjlemesi Ayırmak istenilen molekül santrifüjlenerek belirli yoğunluktaki sezyum klorid içerisine konur Bir gün süresince santrifüj yapıldığında en altta çok yoğun, üstte ise daha az yoğun sezyum klorid konsantrasyonu derecelenmesi görülür Kromozomal DNA izole edildikten sonra içinde plasmid DNA olduğu ihtimali düşünülerek santrifüj işlemi uygulanırsa plasmid DNA daha az yoğunluktaki sezyum kloridde bulunur Karışımlar kendi yoğunluklarına yakın olan konsantrasyonlarda sıralanırlar Ayrıca kromatografik yöntemlerden hidroksiapatit kromatografisi ile ileri derecede DNA’yı saflaştırmak mümkündür.

Prokaryotik DNA İzolasyonu Bakterinin kromozomal DNA’sı Ekstra kromozomal DNA’nın izolasyonu (plasmid, bakteriyofaj)yapılabilir

Kromozomal (Genomik) DNA İzolasyonu İlk aşama bakteri hücre duvarının zayıflatılması Dondurup çözme gibi fiziksel yöntemler ve enzim kullanımına dayalı kimyasal yöntemler Uygun pH ve iyon konsantrasyonları, ultrasonikasyon, dondurup-çözme, blendır gibi yöntemler kullanılır Hücre lizisinden sonra RNA’yı parçalamak için RNaz, proteinleri parçalamak için proteazlar kullanılır Geride kalan proteinleri ve oligopeptidleri parçalamak için fenol veya fenol kloroformun eşit miktardaki karşımı kullanılır DNA bulunan faza alkol ilave edildiğinde yüksek molekül ağırlıklı DNA beyaz ipliksi bir yapı halinde çöker Geride kalan tuz, deterjan gibi safsızlıkların uzaklaştırılması için diyaliz uygulanabilir

Ekstrakromozomal DNA İzolasyonu Kromozomal DNA’nın uzaklaştırılması hedeflenir Bakteriyofaj DNA’sının izolasyonunda infekte bakteriden faj partiküllerinin saflaştırılmasıyla kromozomal DNA’dan arınılmış olunur. Proteaz ve fenol muamelesi ile bakteriyofaj DNA’sı serbest kalır Daha sonraki saflaştırmalar kromozomal DNA’daki gibidir

Plasmid DNA İzolasyonu Kromozomal DNA uygulamalarına benzerlik gösterir Aradaki farklılık kromozomal ve plasmid DNA’larının konfegurasyon bakımından farklı oluşları ile ilgilidir Plasmid DNA’sı halkasal ve süpersarmal bir yapıdadır Yüksek pH, sıcaklık koşullarında denatürasyon ve daha sonra renatürasyon görülür Denatüre edilmiş DNA solüsyonu nötralize edilir veya soğutulursa lineer DNA’da (kromozomal DNA) komplementer zincir tek iplikli iken, süpersarmal DNA’da tek iplikli karışımlar birbirlerine sarılı durumdadırlar. Alkali-lizis ya da yüksek sıcaklık gibi koşullarda denatürasyondan sonra plasmid DNA’sı pH nötralleştiğinde daha kısa sürede renatüre olur. Bu nedenle plasmid DNA’sı kromozomal DNA’dan kolaylıkla ayrılır

Ökaryotik DNA İzolasyonu Ökaryotik hücrelerden DNA’yı izole etmek prokaryotlara göre daha zordur (Nükleus zarı, organellerde DNA bulunur) Tüm hücre (total) DNA’sı izole edilmek isteniyorsa lizis işlemine benzerlik gösteren bir yöntem kullanılabilir Hücre zarı önce dikkatli bir şekilde lizize uğratılarak nükleus ve organellerin zarları parçalanmamış biçimde elde edilir. Boyut, yoğunluk ve çeşitli deterjanlara duyarlılık açısından nükleus, mitokondri ve kloroplast farklılık gösterdiklerinden kolaylıkla ayrılabilirler. Bu organeller lizise uğratıldıktan sonra DNA, RNA proteinlerden arındırılır. Mitokondri ve kloroplast DNA’ları genellikle bir ölçüde kapalı halkasal karışımlar halinde bulunurlar ve plasmid DNA’sının izolasyonuna benzer şekilde izole edilirler

DNA Konsantrasyonu ve Saflığının Kontrolü Nükleotidlerin heterosiklik halkalarının 260 nm dalga boyundaki ışığı maksimum emme derecesi nükleik asitlerin miktarının bir ölçüsüdür. DNA’nın miktar ve saflığı spektrofotometrede 260 ve 280 nm dalga boylarında elde edilecek değerlerden belirlenir. 1 optik dansite (OD)= 50 µg/ml (çift iplikli DNA) 1A 260= 40 µg/ml (tek zincirli DNA/RNA) Oligonükleotidler için 20 µg/ml’ye karşılık gelmektedir. Proteinler UV’yi 280 nm’de maksimum düzeyde absorblar Nükleik asitlerin saflığı 260 ve 280 nm’deki değerler arasındaki oranla belirlenir A260/A280= 1.85-1.9 (saf DNA) Eğer ortamda fenol veya protein bulunuyorsa oran bu değerlerden düşük olacaktır. Çift iplikli DNA miktarı (µg/ml) = 260 nm’deki OD x katsayı (50) x sulandırma oranı

RNA İzolasyonu Hücrenin diğer karışımları ile kontamine olmamış yani biyolojik olarak aktif ve yıkılmamış RNA’ların saflaştırılması demektir (mRNA çabuk yıkılır) RNA saflaştırılmasında en önemli zorluklardan biri endojen RNaz’ların RNA’ları parçalamasıdır. Bu nedenle izolasyon sırasında çeşitli RNase inhibitörleri kullanılmalıdır Bu amaçla EDTA, EGTA (kelatörler), SDS (deterjan), guanidyum izotiyosiyonat gibi kuvvetli denatüre edici ajanlar kullanılmalıdır RNA izolasyonunda kullanılacak cam madde %0.02’lik DEPC (dietilpirokarbonat) ile mutlaka yıkanmalıdır (RNase inhibisyonu için) Steril çalışmaya çok önem verilmelidir İzole edilen RNA’nın saklama koşulu deterjan varlığında veya etanolde -20 ve -80 gibi düşük sıcaklıklardır

Organizma grubuna göre kullanılan maddeler değişmekle birlikte öncelikle hücre lizisi ortak bir özelliktir Proteinlerin uzaklaştırılması için bir hacim fenol kloroform eklenir. Santrifüjleme ile oluşan çökelti ile proteinler uzaklaştırılır. 0.2 M NaOAc (sodyum asetat) ile etanol karıştırılarak santrifüjleme sonunda total nükleik asitler elde edilir 3M NaOAc (pH=6) ilave edilir ve 2-3 saat soğukta bekletildikten sonra santrifüj yapılır. Sıvı fazda olan DNA RNA’dan ayrılır RNA ise NaOAc ve etanol ile elde edilen pellette bulunur Tüpteki örnek kurutulur, uygun çözücü veya deiyonize su ile çözüldükten sonra -20 oC’de saklanabilir. Özellikle polisakkaritler gibi kontaminantların uzaklaştırıması için CsCl2 derecelenme santrifüjlemesi (16 h 25000 rpm) kullanılır.

Saflığını kontrol etmek için spektral olarak ölçüm yapılır Saflığını kontrol etmek için spektral olarak ölçüm yapılır. A260/A280=2 ise RNA çok saftır. Total RNA karışımından mRNA izole etmek istenirse mRNA’nın 3ı ucundaki poliA kuyruğundan yararlanılır. PoliA mRNA’yı taşınma sırasında enzimlerden korur ve hareketini sağlar mRNA kromatografik olarak ayrılabilir Oligo(dT) selüloz veya poli U sefaroz kullanılarak yapılan kromatografi ile mRNA’nın poliA kuyruğu yüksek tuz konsantrasyonunda kolona bağlanarak diğer RNA türlerinden ayrılır. Bağlı mRNA’nın kolondan ayrılması ise düşük tuz konsantrasyonları ile gerçekleştirilir