400100710021-Bitkilerde Fonksiyonel Genombilim http://biotek.ankara.edu.tr/ 400100710021-Bitkilerde Fonksiyonel Genombilim Prof. Dr. Ali ERGÜL Ankara Üniversitesi, Biyoteknoloji Enstitüsü

HAFTA-1 Bitki Genom Yapısı HAFTA-2 HAFTA-3 RNA İzolasyonu HAFTA-4 RNA İzolasyonu-UYGULAMA HAFTA-5 Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri: Real Time PCR HAFTA-6 Real Time PCR-UYGULAMA HAFTA-7 HAFTA-8 Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri: Mikroarray-RNA dizileme HAFTA-9 HAFTA-10 Bitkilerde Ters Genetik -miRNA HAFTA-11 Tüm Genom Dizileme Çalışmaları HAFTA-12 Bitki Genom Projelerine Genel Bakış HAFTA-13 Bitkilerde Genom Düzenlenmesi (CRISPR/Cas9) HAFTA-14 Moleküler Tarım

HAFTA 13: Bitkilerde Genom Düzenlenmesi (CRISPR/Cas9)

CRISPR/Cas9 Transgenik olmayan bitkilerin geliştirilmesinde genom düzenleme (genom editing) teknikleri devreye girmektedir. Yakın geçmişte, ZFNs (zinc finger nucleases: Çinko Parmak nükleazları), TALENs (transcription activator like effector nucleases: transkripsiyon efektör benzeri nükleazlar) ve CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated 9:Düzenli Aralıklarla Bölünmüş Palindromik Tekrar Kümeleri/CRISPR ilişkili Cas 9) sistemlerinin herhangi bir genomda, hedeflenen bölgenin değiştirilmesinde uygulanabilir bir araç olduğu kanıtlanmış ve bitkilerde kullanımı başlanmıştır.

CRISPR/Cas9 ZFN, TALEN ve CRISPR/Cas sistemleri yada RGEN (RNA-guided engineered nucleases: RNA yönlendirmeli tasarlanmış nükleazlar) gibi genom düzenleme teknolojileri, bitkinin doğal genomik DNA dizilerindeki değişimle fonksiyonel olarak devreye geçirilmekte ve etkin şekilde kullanılabilmektedir. ZFN'ler ve TALEN'ler özellikle tekniksel anlamda karmaşıklık içermesi ve sınırlı verimlilik gibi dezavantajlara sahipken, CRISPR/Cas9 sistemi hem basit hem de yüksek verimlilik özelliklerine sahiptir.

CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9, prokaryotlarda bağışıklık sisteminin bir parçası olup ve DNA'yı diziye bağımlı bir şekilde parçalayarak virüs gibi etmenlere karşı prokoryotlarda DNA koruması sağlamaktadır. Streptococcus pyogenes'da CRISPR/Cas9 sistemi 2 komponent ile çalışacak şekilde tasarlanmıştır. Bu komponentler: spesifik olmayan Cas9 endonükleaz ve Cas 9 u hedef DNA ile komplement oluşturacak protoaralıklara sahip spesifik genomik bölgeye yönlendiren ve hedef bölgede Çift Zincir kırılmaları (double-strand breaks-DSBs) yaratan tek zincir RNA (sgRNA: single guide RNA veya gRNA: guide RNA)’ dır.

CRISPR/Cas9 Bakteriyel kromozomda CRISPR bölgesi içerikleri

CRISPR/Cas9 Bu DSB'ler (çift zincir boşlukları) daha sonra hata eğilimli homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ: non-homologous end joining) veya homolog rekombinasyon (HR:homologous recombination) yollarından, hücresel DNA onarım yollarını tetiklemektedir. Onarım yoluna bağlı olarak farklı yere özgü DNA dizi modifikasyonları yapılabilmektedir (Symington ve Gautier, 2011). NHEJ'in onarımı çoğunlukla kodlama bölgesinde olması halinde gen susturmasına neden olan ekleme veya silme (INDEL) mutasyonuna neden olmaktadır. Alternatif olarak, DSB'yi çevreleyen diziye homoloji gösteren DNA şablonu bulunuyorsa, gen modifikasyonu yoluyla kolayca elde edilebilmektedir.

CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9 sistemi çalışma mekanizması

CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9 sistemi istenilen genomik bölgeyi hedef alacak şekilde kolayca programlanabilmekte ve gerçek anlamda DNA düzenlemesine olanak tanımaktadır. Genomda spesifik Cas9 katalizli DNA kesilmesi için gerekli şart, gRNA sekansı ile tamamlanacak özellikte 20 nükleotidlik dizi ve sonrasında protoaralık bitişik motiflerin (protospacer adjacent motif-PAM) spesifik tanınması ile belirlenmektedir. Spesifik hedef bölgelerinin seçimi ise günümüzde kullanılan CRISPR-Plant, GT-scan, CRISPR direct programları ile gerçekleşmektedir.

Crıspr/Cas9 Uygulamaları Sebze türlerinde: Günümüzde model bitkilerden Arabidopsis thaliana'da (AtPDS3, AtFLS2, AtADH, AtFT, AtSPL4, AtCHL1, AtTT4, AtAP1, AtGUUS ve AtBRI1 gibi) ve Nicotiana benthamiana'da (NbPDS, NbPCNA ve NbPDR6), Oryza sativa’da (OsSWEET11, OsSWEET11, OsSWEET14, OsCAO1, OsLAZY, OsROC5, OsSPP, OsYSA, OsPDS, OsBADH2, Oso2g23823, OsMPK2 ve OsBEL) bir çok gen CRISPR/Cas9 sisteminde etkili bir şekilde hedeflenmiştir.

Crıspr/Cas9 Uygulamaları CRISPR/Cas9 sistemi uygulamaları pirinç ve buğday gibi ürünlerde daha çok uygulanmasına karşın, bahçe bitkilerinde de uygulamaları bulunmaktadır. Sebzelerde çalışmalar ağırlıklı olarak domateslerde gerçekleştirilmiş, ilk CRISPR/Cas9 aracılığı ile genom editing ise, 2014 yılında yaprak gelişiminde rol alan domates ARGONAUTE7 (SlAGO7) geninin hedeflenmesi ile başarılmıştır.

Crıspr/Cas9 Uygulamaları Bu genin (SlAGO7) fonksiyon kaybı ile iğne yaprak oluşumu artmıştır. Bundan sonraki çalışmalarda ise, SHR (SHORTROOT- kök gelişimi; SIBP (BLADE-ON-PETIOLE-çiçeklenme ve SP (SELF PRUNING- bitki gelişimi) genleri hedeflenmiştir. Ayrıca lahanada Gibberellin3-beta-dioxygenase 1 ve marul BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 2 gelişim genleri hedeflenirken, domatesde biyosentetik yolak genlerinden; antosiyanin biyosentezinde ANT1 (Antosiyanin 1), SlPDS (Phytoene desatüraz), SlPIF4 (Phytochrome etkileşen faktörü) ve karotenoid sentezinde görev yapan PSY1 geni (Phytoene sentez) CRISPR/Cas9 ile mutasyona uğratılmıştır.

Crıspr/Cas9 Uygulamaları 2017 yılında yapılan bir çalışmada, iki domatesin melezlenmesi sonrası ortaya çıkan heterozigotik genomda, Cas9 ve gRNA’nın stabil bir şekilde korunduğu bunun ise özellikle crossing over esnasında korunan kromozom bölgelerindeki genlerin hedef alınması açısından önemli olduğu vurgulanmıştır. 2017 yılında oksin sinyal yolağında yer alan SlIAA9 geninde mutasyon yaratarak partenokarpik domates çeşitleri geliştirilmiştir.

Crıspr/Cas9 Uygulamaları Sebzelerde de metabolik mühendisliği, beslenme kalitesini yükseltmek için öne çıkan alanların başında gelmektedir. Ancak, metabolik modifikasyonlarda birden fazla yolak bulunduğu için çok sayıda geni hedeflemek gerekmekte dolayısıyla bu yönlü çalışmalar daha zor aşamaları içermektedir. Metabolik mühendisliğine yönelik CRISPR/Cas9 çalışmalarında domateste dört karbonlu protein oluşturmayan amino asit, GABA (g-aminobütirik asit) geninin manipüle edilmesi sonucu, bu gen tarafından kontrol edilen GABA birikiminden sorumlu 5 genin fonksiyonu etkilenmiş, hem yapraklarda hem de meyvelerde GABA birikiminde belirgin bir artış sağlanmıştır.

Crıspr/Cas9 Uygulamaları Bu araştırmada CRISPR/Cas9 sistemi, tek bir transformasyon sonrası birden fazla genin susturulmasında kullanılmış, böylelikle sebzelerin metabolik mühendisliğindeki uygulanabilirliği ile mültipleks uygulamalar olarak karşımıza çıkarılmıştır. CRISPR/CAS9 aynı zamanda sebzelerde hastalıklara dayanıklılık amacı ile kullanılmaktadır. Bitkilerde hastalıklara dayanıklılıkta, “dayanıklılık” ve “hassaslık” genleri yer almaktadır. İlgili patojene ait “hassaslık genlerinin” susturulma konakçıyı dayanıklı hale getirmektedir. Domatesde Oidium neolycopersici fungusunun neden olduğu mildiyöye karşı iki farklı sgRNA bölgesi hedeflenerek transgenik olmayan dayanıklı bitkiler geliştirilmiştir.

Crıspr/Cas9 Uygulamaları RNA virüsleri yaşam döngüsünü korumak için bitki hücresine ihtiyaç duymaktadır. Bu virüslerin yaşam dögülerini devam ettirmesinde ve ökaryotik translasyon başlatma faktörü eIF4E gerekli olan ana faktörlerden biridir. Domates ve kavunda eIF4E geninin miRNA aracılığı ile susturulması ile önceki yıllarda geniş spektrumlu RNA virüsü dayanıklılığına ulaşılmıştır. CRISPR/CAS9 yöntemini kullanılarak, potifviridae ailesine ait virüslere karşı geniş spektrumlu dayanıklılık, çalışmaları ise, bitki translayon faktörü (eIF4E) genleri kullanılarak gerçekleştirilmiş ve bu genlere yönelik oluşturulan 2 adet gRNA bölgesi ile gerçekleştirilen çalışmada salatalıkta transgenik olmayan bitkiler üretilmiştir.

Crıspr/Cas9 Uygulamaları Meyve türleri besin kaynağı olarak çok önemli olmasına rağmen, çok yıllık olmaları ve türlerde zaman alıcı uzun ıslah programlarından dolayı meyve araştırmalarına sebzelere oranla daha az önem verilmektedir. Bu nedenle, süreci kısaltmak için transgenik veya genom mühendisliği yaklaşımları meyve türlerinde daha büyük önem arz etmektedir. Meyvelerde CRISPR/Cas9 temelli genom düzenleme çalışmaları henüz çok yeni olup şu ana kadar literatürde çok az sayıda çalışma rapor edilmiştir. Hassaslık genlerinden CsLOB1geninin, promotör bölgesine bağlanan trans elementlerde hedef alınan bölgelerin, CRISPR/Cas9 ile susturulması ile limon çürüklüğüne karşı dayanıklı bitkilerin geliştirilmesi çalışmaları devam etmektedir.

Crıspr/Cas9 Uygulamaları Limon dışında, CRISPR / Cas9 tarafından yapılan genom editing uygulamaları olarak karpuzda ve üzümde, karatenoid biyosentezinde yol alan Phytoene desatüraz geninin hedeflenmesini içeren çalışmalar örnek gösterilebilmektedir. Ayrıca CRSIPR/Cas9 temelli genom editing uygulaması için bazı hedef bölgelere ait veri tabanları geliştirilmiş durumdadır. Örneğin üzüm de spesifik veri tabanı olarak "Grape-CRISPR" veri tabanı kullanılabilir durumda olup, bu tür veri tabanları, özellikle hedef bölgelerin belirlenmesine yönelik yapılan çalışmalar sonraki çalışmalara öncülük etmektedir.

Ders Kapsamında Yararlanılan Kaynaklar Functional Plant Genomics (Editors:J.-F. Morot-Gaudry, P.Lea, J.-F.Briat) Genomics-Assisted Crop Improvement Volume 1 Genomics Approaches and Platforms (Editors:Rajeev K.Varshney, Roberto Tuberosa) Pant Functional Genomics (Editors:Erich Grotewold) Karkute, S.G., Singh, A.K., Gupta, O.P., Singh, P.M., Singh, B. 2017. "CRISPR/Cas9 mediated genome engineering for improvement of horticultural crops", Frontiers in plant science, 8, 1635. Obembe, O. O., Popoola, J. O., Leelavathi, S., & Reddy, S. V. (2011). Advances in plant molecular farming. Biotechnology aadvances, 29(2), 210-222.