BİY 433 BİTKİ DOKU VE HÜCRE KÜLTÜRÜ ( Ders Notları) Prof. Dr. A. Sülün ÜSTÜN Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü

Bitki doku ve hücre kültürü; aseptik şartlarda, yapay bir besin ortamında, bütün bir bitki, hücre (meristematik hücreler, süspansiyon veya kallus hücreleri), doku (çeşitli bitki kısımları =eksplant) veya organ (apikal meristem, kök vb.) gibi kısımlarından yeni doku, bitki veya bitkisel ürünlerin (metabolitler gibi) üretilmesi temel olarak araştırılmaktadır

Temel sistem BİTKİ REJENERASYONU 1) organize olmuş meristematik hücreleri ihtiva eden somatik dokulardan rejenerasyon, 2) meristematik olmayan somatik hücrelerden rejenerasyon ve 3) mayoz bölünme geçirmiş gametik hücrelerden rejenerasyon. Temel sistem REJENERASYON DUR

Bitki Doku Kültürlerinin Tarihi Gelişimi ve Uygulama Alanları

Bitki Doku kültürlerinin bitki ıslahındaki uygulama alanları Türler arası melezlemelerden sonra embriyo kültürü Haploid bitki üretiminde anter (polen) ve yumurtalık (ovül) kültürü Soma klonal varyasyon İn vitro seleksiyon İn vitro döllenme İn vitro germplazm muhafazası

Somatik hücre melezlemesi (protoplast fizyonu) Gen transferi Bitki doku kültürünün ticari ve ıslah dışı uygulamaları Hastalıksız bitki elde edilmesinde meristem kültürü Mikroçoğaltım Sentetik tohum üretimi (somatik embriyolar) Sekonder metabolit üretimi (kallus-hücre süspansiyonları) Kimeralar

2 Temel araştırmalardaki uygulamalar Temel Teknikler 1)Uygun bir laboratuvar düzenini kurulması, 2)Kullanılacak bitki parçalarının (eksplant) ve besin ortamlarının seçimi, hazırlanması ve sterilizasyonu, 3)Kallus ve hücre süspansiyonlarının oluşturulması, 4)Kallus veya hücre süspansiyonlarından veya doğrudan somatik veya gametik hücrelerden bitki rejenerasyonunun uyarılması, 5)Oluşan sürgünlerin çoğaltılması ve boylarının uzatılması, somatik embriyoların olgunlaşması, 6)Uzayan sürgünlerin köklendirilmesi, 7)Köklenen bitkilerin dış ortama alıştırılması (aklimatizasyon).

3 Sterilizasyon teknikleri İn vitro (laboratuvarda ve steril şartlarda) doku kültüründe en önemli nokta sterilizasyon işlemleridir Sterilizasyon, sterilize edilecek yer ve materyale göre 3 kısımda değerlendirilebilir: 1)Çalışma alanının sterilizasyonu, 2)Kullanılacak alet, ekipman, kapların ve besin ortamlarının sterilizasyonu (ısı ile bozulabilenler, ısı ile bozulmayanlar) 3)Bitki materyalinin sterilizasyonu

Besin Ortamları Tablo 5. Bitki doku kültüründe en çok kullanılan temel besin ortamları Tablo 6. Stok solüsyonlarla MS besin ortamının hazırlanması-1 Tablo 7. Stok solüsyonlarla MS besin ortamının hazırlanması-2 Tablo 8. Bitkilerce alınabilir şekerler

Stok solüsyonların hazırlanması ve saklanması Bitki büyüme düzenleyicileri Tablo 9. Bitki doku kültüründe en çok kullanılan bitki büyüme düzenleyecileri Tablo 10. Uygulama alanları ve etki şekillerine göre bitki düzenleyici, engelleyici ve hormon grupları Kültür Şartları

4 Denemelerin Planlanması ve Data Analizi Mikroskopi ve Görüntüleme Laboratuvarda Güvenlik Tablo 13. Bitki doku kültüründe üzerinde çalışılan bazı konular, uygulanan teknik ve sistemler

5 Bitki Doku Teknikleri   Çoğaltma Amacıyla Kullanılan Doku Kültürleri Teknikleri

Meristem kültürü 1 Meristem kültüründe izole edilen meristemin büyüklüğü hem kültürün amacını hem de başarı oranını büyük ölçüde etkilemekte, dokunun büyüklüğü arttıkça başarı yükselmekte buna karşılık alınan meristtemin büyük olması virüslü bitki elde edilmesi tehlikesini arttırmaktadır

Virüslerin bitkilerden eliminasyonu için önceleri sadece termoterapi yöntemi kullanılmaktaydı. Ancak birden fazla virüs tarafından enfekte edilmiş her virüs farklı bir sıcaklıkta inaktive olduğu için tüm virüslerin termoterapi ile eliminasyonu mümkün olmamaktadır. Bu yüzden son yıllarda tek başına termoterapi kullanılması yerine, termoterapi ile meristem kültürünün kombinasyonu yoluyla virüssüz bitki elde edilmesine yönelik çalışmalar hız kazanmıştır

Meristem kültürü 4 aşamadan oluşur  1. Meristemlerin izolasyonu ve kültür ortamlarına dikilmesi. 2. Büyümenin başlatılması ve sürgün oluşturma 3. Oluşan sürgünlerin köklendirilmesi 4. Köklü bitkilerin saksılara şaşırtılması ve dış ortama alıştırılması

9 Sürgün ucu kültürü Sürgün ucu kültürü tekniği bitkilerin mikro çoğaltılmasında koltuk sürgünü proliferasyonu amacıyla kullanılmaktadır. Bu teknikte kullanılan eksplanta, büyüme konisi ile bunun hemen altında bulunan birkaç adet yaprak taslağını içerdiği için “mikro çelik” ya da “minyatür çelik” ismi verilmektedir. Sürgün ucu kültüründe kullanılan bitki parçası meristem kültüründe kullanılan parçaya göre daha büyük olduğu için eksplantın gelişmesi çok daha hızlı olmakta ve aynı zamanda bir vegetatif çoğaltma tekniği olduğu için klonal bir çoğaltma sağlamaktadır •Bu teknikle, mantari ve bakteriyel hastalık etmenlerinden bir ölçüde korunmak mümkündür. Ancak, virüssüz ve hastalık etmenleri ile bulaşık olmadığı garanti edilemez

Mikro Aşılama Mikro aşılama tekniği, gerek vegetatif gerekse generatif yöntemle çoğaltılan tepesi vurulmuş anaç olarak kullanılan bir bitkicik üzerine, 0.1-0.4 mm uzunluktaki sürgün ucunun in vitro koşullarda aşılanmasıdır. Anaç olarak kullanılacak bitkilerin 1.5 cm’lik epikotil kısmı bırakılarak tepeleri kesilir. Kotiledonlar ve koltuk altı tomurcukları çıkarılır. Kök ise, 2-4 cm’lik uzunlukta kesilir . Kalem olarak kullanılacak sürgün ucu parçası “TersT” şeklinde ya da yatay kesilmiş epikotil üzerine yerleştirilir  

Mikro aşılama tekniğinin kullanım amaçları: • Bu teknik, virüssüz bitki elde etmek için kullanılan en uygun tekniktir. • Mikro aşılama tekniği, sürgün ucu kültüre alındığında, tam bir bitki oluşturamayan tür ve çeşitlerde kullanılmaktadır. • Ayrıca türler arası aşılamada uyuşma mekanizmasını incelemek amacıyla kullanılan bir tekniktir.

8 Gen kaynaklarının Muhafazası Amacıyla Doku Kültürü Tekniklerinin Kullanımı Doku kültürü tekniklerinden yararlanarak, bitkisel materyallerin muhafazası başlıca iki yöntemle yapılmaktadır a. Kültürün gelişmesinin minimuma indirerek muhafaza b. Kültürü dondurarak muhafaza

Islah Amacıyla Kullanılan Doku Kültürü Teknikleri Embriyo Kültürü Embriyo Kültürü, gelişmenin belirli bir devrisinde ovaryum içerisinde bulunan embriyoların steril koşullarda izole edilerek uygun bir besi ortamında çimlendirilerek geliştirilmesidir Embriyo kültürü iki şekilde gerçekleştirilebilir a. Henüz tam olarak olgunlaşmamış tohumlardan alınan olgunlaşmamış embriyoların kültüre alınması b. Olgun tohumlardan izole edilen tam olarak olgunlaşmamış embriyoların kültürüdür Embriyonun tohumdan çıkarılmasının güç olduğu durumlarda “Ovaryum Kültürü” ya da “Ovul Kültürü” kullanılmaktadır

7 Anter Kültürü Özellikle ıslah çalışmalarında önemli olan bir yöntemdir. Anter kültürü ile haploid bitkiler, direkt androgenesis ve indirekt androgenesis yoluyla gerçekleşmektedir Anter kültürünün yanı sıra haploid bitki elde edilmesi amacıyla döllenmiş tohum taslaklarında kullanılabilmekte ve bu amaçla somatik embriyogenezsis teşvik edilmektedir. Döllenmiş tohum taslağının içindeki gametik kromozom sayısına sahip olan yumurta hücrelerinden embriyo oluşumu ve bitki gelişimi sağlandığında, haploidi ıslahından yararlanılarak homozigot bireyler elde edilebilir

Protoplast Kültürü Protoplast kültürü ise, izole edilen protoplastların katı yada sıvı besin ortamları içerisinde hücre modifikasyonu ve somatik hidridizasyon yoluyla bitki tür ve çeşitlerinin geliştirilmesi amacılya in vitro koşullarda geliştirilmesi işlemidir Protoplast kültürünün aşamaları: a.Yaprak sterilizasyonu, b.Epidermisin soyulması, c.Enzim uygulaması ve inkübasyon, d. Protoplast izolasyonu ve inkübasyonu ve kültüre alınmasıdır Protoplasların kültüre alınması sonucunda uygun şartlarda protoplastlardan meydana gelen kalluslar farklılaşarak sürgün ve kök oluşturabilmektedir

Kallus Kültürü Kallus kültüründe kullanılacak bitki dokuları genellikle gövde ve köklerin iletim alanlarının yanındaki bölünebilme özelliğine sahip dokulardır. Bunun yanında meyve, endosperm, polen ya da olgun/olgun olmayan embriyo kallus kültüründe başlangıç materyali olarak kullanılmaktadır. Kallus Kültürünün Kullanım Amaçları: Genetik varyasyon yaratmak suretiyle, bunlar içinden ıslah amacına uygun olanların seçilmesi, Kallus dokularından yararlanılarak aşı uyuşmazlıklarının belirlenmesi amacıyla kullanılır

11 Sekonder Metabolit Üretimi. Ekonomik önemleri, Bitkilerde bulunan, türlere özgü bir çok sekonder metabolitin insanların yararlanabilecegi bir çok alanda (tıp, ecza, kozmetik, ziraat, gıda vb) kullanılması bu grupda yer alan maddelerin daha fazla elde edilebilir olmasını sağlayacak bazı teknikler ile elde edilmesi bir çok çalışmada amaçlanmıştır. Bu tekniklerden biriside , bitkinin çeşitli kısımlarını doku ya da hücre süspansiyon kültürü kullanılarak uygun miktarlarda maddenin elde edilmesi son yıllarda kullanılabilir bir yol olarak karşımıza çıkmaktadır

Genel olarak tüm tekniklerde karşılaşılan sorun, bazı özgün sekonder metabolitlerin üretimindeki düşük verimliliktir Farklılaşmış ve organize olmuş kültürler ile metabolit üretimi çalışılarken bitkinin büyüme peryodunuda göz önüne almak gerekir. Morfolojik olarak farklılaşma eğilimindeki organ, doku, hücre veya hücre gruplarında potansiyel olarak sekonder metabolit üretim olanağı daha fazla olmaktadır.

Farklılaşmış ve organize olmuş kültürler ile metabolit üretimi Çeşitli araştırmanın sonuçlarına gör sekonder metabolitin fazla olduğu kısımların kültüre alınması daha uygundur Kök kültürleri Sürgün kültürleri Embriyo kültürleri Farklılaşmamış ve organize olmamış kültürler ile metabolit üretimi

Farklılaşmamış ve organize olmamış kültürler ile metabolit üretimi Kallus kültürleri TABLO 14. Hücre süspansiyon kültürleri .

Kallus kültürleri de hücre süspansiyon kültürleri için başlangıç materyali olabilir. Bu durum teknik açıdan daha avantajlıdır. Çünkü in vitro ortama uyum sağlamış, belli bir büyüme oranı sabitesine sahip kallus kültüründen alınan parçalar, ana bitkiden alınan parçalara göre sıvı ortama daha çabuk adapte olmaktadır. Kallustan alınan parçaların kolayca ayrılıp sıvı ortam boyunca daha homojen dağılım göstermesi ise hücre süspansiyon kültürüne başlamada avantaj sağlamaktadır. Sekonder metabolitlerin üretilmesi konusunda hücre süspansiyon kültürleri diğer tekniklere ve özellikle kallus kültürlerine göre daha avantajlı sistemlerdir. Bu avantajlardan en önemlisi, bu sistemlerin kallus kültürlerine göre daha çabuk büyümesidir. Hücre süspansiyonlarında kaynak bitkiden çok daha fazla ürün birikimi olduğuna dair birçok örnek bulunmaktadır

Süspansiyon Kültürlerinde Sekonder Ürün Veriminin Artırılması Sekonder ürün miktarını değişen fiziksel ve kimyasal çevre koşulları oldukça etkiler (Tablo 17 ) Aynı zamanda kültür ortamında bulunan besinler; yani karbon, fosfor, azot kaynakları ve diğer makro elementler ile bitki büyüme düzenleyicileri; yani oksinler ve sitokininler hem büyümeye hem de metabolit oluşumuna etki etmektedir Bunların yanı sıra, bitkisel koşullarda, kültür tipine, hücre hattına ve hatta kültürün yaşına göre etkilidir

Öncüller (Precursors) Bitki doku ve hücre kültürlerine öncül ve/veya ara maddeler ekleyerek sekonder metabolit üretiminde artış sağlamaya yönelik araştırmalar son yıllarda oldukça fazlalaşmıştır Bitki hücre kültürlerine öncüller ilave ederek sekonder metabolitin üretimini arttırma yönteminde göz önünde bulundurulması gereken bir takım ön koşullar bulunmaktadır. Öncelikle bu maddelerin toksik olmayan derişimlerinin saptanması, kültür ortamına ilave etmek için en uygun zamanın belirlenmesi, hücre içine alınma ve birikim mekanizmalarının ortaya çıkarılması ve bu maddelerin kullanımını sağlayan enzimlerle ilişkilerinin bilinmesi gerekmektedir

Elisitörler Sekonder metabolitlerin bir kısmı bitkinin yapısında hazır bulunan bir kısmı ise ancak bitki- uyarıcı interaksiyonunda yeni sentezlenebilen maddelerdir. Bu gibi maddeler bitkilere özgü şekilde bulunurlar. Abiyotik elisitörler: biyolojik olmayan (UV, ağır metal iyonları, deterjanlar vb.) Biyotik elisitörler biyolojik kökenli çok çeşitli yapıda maddeler olabilir,( polisakkaritler, proteinler, glikoproteinler, bakteri, mantar, nematod ve hatta bitkisel kaynaklı hücre çeperi parçalanma ürünleri vb)

Biyotik elisitörler ise oluşum ve birikim durumlarına göre 4 ana başlıkta toplanabilir 1. Doğrudan mikroorganizmalar tarafından salınan ve bitki hücrelerince tanınanlar 2. Mikroorganizmaların bitki hücre çeperlerindeki işlevi sonucu oluşanlar

3. Mikroorganizma üzerinde bitki enzimlerinin işlev görmesi ile oluşanlar 4. Çeşitli uyarıcı etkenlere yanıt olarak bitki hücreleri tarafından oluşturulan ve ortama salınan endojen ve her zaman doğada mevcut olan bileşikler. Bitkilerden ve bitki hücre kültürlerinden çok sayıda fitoaleksinler izole edilmiştir. Bu bileşiklerin kimyasal yapıları büyük çeşitlilik gösterse de, karbon iskeletlerinin belli bir tür veya familya için karakteristik olması, fitoaleksinlerin kemotaksonomide kullanışlı işaretler olmasını gündeme getirmektedir

12 Tutuklama( immobilizasyon) Aslında tutuklanma, mikroorganizmalarda uzun zamandan beri uygulanan bir tekniktir. Acetobacter hücrelerinin tutuklandığı geleneksel sirke üretme yöntemi tipik bir tutuklanma tekniğidir Hücrelerin bütünüyle tutuklanmasına dair ilk rapor 1960’lı yıllara dayanmaktadır. Bu raporda, bir liken olan Umbilicaria pustulata hücrelerinin poliakrilamid jel içinde tutuklandığı belirtilmiştir (Mosbach ve Mosbach, 1966). Bir sonraki yıl, embriyonik hayvan hücrelerinin tutuklanması da gerçekleştirilmiştir (Wezel,1967) Sonraki yıllarda, çoğunlukla mikroorganizmaların yer aldığı, çeşitli mikroorganizmaların, bitki ve hayvan hücreleri ile organellerin değişik matriksler kullanılarak tutuklandığına dair bir çok rapor literatürlerde yerini almıştır

Bitki hücrelerinin tutuklanması nispeten yeni bir düşüncedir Catharanthus roseus ve Daucus carota hücrelerinin aljinat yatakta tutuklanması, ilk rapor edilen bitki hücrelerinin tutuklanması tekniğidir (Bordeliue ve ark, 1979). Ancak tekniğin temeli, enzim ve/veya mikroorganizmaların tutuklanması temeline dayanmaktadır.

Tutuklanma işlemi, izlenecek tekniğe göre dört ana sınıfa ayrılabilir 1. Hücrelerin inert yatağa tutunmaları (adsorbsiyon), 2. Hücrelerin(enzimlerin veya organellerin); aljinat, agar, poliakrilamid, kollajen vb. gibi inert (tepkisiz) bir yatakta tutuklanmaları, 3. Hücrelerin biyolojik makro moleküllerle (lektinler) yatağa bağlanması, 4. Hücrelerin karboksimetil selüloz gibi inert bir yatağa kovalent bağlanması

Tutuklanmış bitki hücre kültürleri ile sekonder metabolit üretimi başlıca üç ana grupta toplanabilir. Bunlar; 1. biyotransformasyon, 2. öncüllerden biyosentez ve 3. bileşiklerin de novo sentezi

Tutuklanmış hücrelerin bulunduğu ortamda çabuk ve etkin düzenlemelere gidilebilir. Örneğin, ortama öncül maddeler, büyüme düzenleyicileri ve besin maddeleri çabucak ve kolaylıkla eklenebilir. . Bitki hücrelerinin tutuklanması tekniği ile sekonder metabolit üretimi başlıca şu avantajları sağlamaktadır. Tutuklanmış hücrelerde büyüme doğal olarak sıvı ortamdaki hücrelere göre daha yavaş gerçekleşir. Bu durum biyomasın daha uzun süre alıkonmasını sağlayacak, metabolit hücrelerden salındığı ve ortamdan kazanıldığı sürece sistem sürekli olarak çalışabilecektir Halbuki sıvı hücre kültürlerinde bir süre sonra alt kültür (pasaj) yapma gereği duyulmaktadır

Daha çok biyomas verimi elde edilebilir Daha çok biyomas verimi elde edilebilir. Ayrıca ortama ‘genç’ hücrelerin ekimi ve ‘yaşlı ‘ hücrelerin çıkarılması ile sistemin ‘gençleştirmesi’ sağlanabilir. Tutuklamada hücreler besin ortamından matriksle ayrıldığı için salınan ürün kolaylıkla kültürden ‘hasat’ edilmektedir. Sistemin sürekli ve kararlı doğası, oluşabilecek bazı biyokimyasal değişiklikleri ve yan ürün tepkimelerini ortadan kaldırmaktadır

Büyüme ve ürün oluşumu arasında kesin bir ayırım yapılabilmektedir Büyüme ve ürün oluşumu arasında kesin bir ayırım yapılabilmektedir. Böylelikle ürün optimizasyonu büyümeyi engellememektedir Agregat oluşumu ve mekanik hasarlara duyarlılık gibi büyümeye bağlı olarak ortaya çıkan, bazı sorunlar tutuklanmış hücreleri etkilememektedir

Bitki hücrelerinin tutuklanmasında, 1. Tutunma (adsorpsiyon), 2. Kovalent bağlanma ve 3. Tuzaklama yöntemleri daha fazla kullanılmaktadır

Tutunma Bitki hücrelerinin jellatin, agar, aljinat, polipropilen, polistiren ve cam gibi katı desteklere tutundurulmasıdır. Katı destek üzerine ince film halinde tutundurulmuş hücrelerin büyüme ortamı ile doğrudan teması, beslenme ile ilgili sınırlamaları ortadan kaldırmaktadır. Bu durum tutunma yöntemine avantaj sağlamaktadır. Catharantus roseus hücrelerinin kalsiyum aljinatla kolon reaktöre tutundurulması örnek olarak verilebilir

Kovalent Bağlanma Glutaraldehit ve karbodimidler gibi bağlayıcı maddeler ile mikroorganizmaların cam gibi katı desteklere bağlanması yöntemi uzun zamandan beri uygulanmaktadır. Ancak, bu maddelerin bitki hücreleri için oldukça reaktif olması bu yöntemin bitki hücrelerine uygulanmasını zorlaştırmaktadır. Yine de Solanum aviculare’nin glutaraldehit ile polifenilen oksite bağlanarak glikoaldehidlerin üretimi örnek olarak verilebilir

Tuzaklama: Bitki hücrelerinin tutuklanmasında en sık kullanılan yöntemdir. Tuzaklamada çeşitli alt yöntemler uygulanmaktadır. Bunlar arasında polimer oluşturulması, gözenekli yapıların kullanılması ve kuşatma (confinement) en çok kullanılan yönemleridir. Polimer oluşturmada aljinat, agar, karrajen gibi doğal polimerlerin yanı sıra poliakrilamid gibi sentetik polimerler de kullanılabilir. Polimerleşme yanı sıra poliakrilamid gibi sentetik polimerler de kullanılabilir

Bitki hücrelerinin tutuklanmasının nispeten yeni bir yöntem olmasından dolayı sekonder metabolitlerin üretimi konusunda bazı sorunlar yaşanabilmektedir. Bu sorunların arasında kullanılacak besi ortamının seçimi, ürün oluşumu ve salınımı ile destek maddesinin doğası ve bitki hücrelerine uygun olup olmayışı sayılabilir. Ancak, bu sorunlar giderilemeyecek kadar büyük değildir. Sonuç olarak tutuklanma yönteminin, sekonder metabolitlerin bitki hücreleri tarafından üretilmesi konusunda bazı pratik ve ekonomik yararlar sağladığı açıktır.

Senkronize (eşzamanlı) kültürler Hücre süspansiyon kültürlerinde karşılaşılan başlıca sorunlardan biri oda hücrelerin eş zamanlı olarak bölünmemesidir. Bu durum kültürlerde sıklıkla karşılaşılan heterojen hücre populasyonuna neden olmaktadır. Heterojen yapı da doğrudan veya dolaylı olarak metabolit üretimi konusunda bazı dezavantajları gündeme getirmektedir. Eşzamanlı büyüme sistemleri gerek hücre bölünmesinde ve gerekse metabolik süreçlerin aydınlatılmasında da kullanışlı araçlardır

İki aşamalı kültürler Büyüme ve sekonder metabolit üretimi arasındaki zıt ilişki, bu kültür sistemini gündeme getirmiştir. Bu yöntemde hücreler öncelikle büyüme için uygun ortamda kültüre alınmakta ve daha sonra sekonder metabolit üretimi için uygun olan ortama aktarılmaktadır

Biyodönüşüm (Biyotransformasyon) Bitki biyoteknolojisinin en ilgi çekici konularından birisi de biyodönüşümdür. Biyodönüşüm aynı zamanda bitki doku ve hücre kültürleri ile sekonder metabolitlerin üretiminin önemli bir öğesidir. Metabolit üretimi konusunda diğer yöntemlerde olduğu gibi, biyodönüşümün temeli de ilk kez mikroorganizmalarda yapılan araştırma ve uygulamalara dayanmaktadır. Mikroorganizmaların rol oynadığı fermantasyon olayları da aslında temel olarak biyodönüşüm olayından başka bir şey değildir. Örneğin, üzüm suyundan şarap veya sirke üretimi biyodönüşüm ile gerçekleştirilen ve insanlık tarihi kadar eski bir yöntemdir

Bitki hücre kültürleriyle başarılı ve etkin bir biyodönüşüm için yerine getirilmesi gereken bazı ön koşullar vardır. Bunların başlıcaları; Dönüşümü sağlanacak substrat ve sonuçta oluşan ürün bitki hücre kültürleri için toksik olmamalıdır. Substratın hücre içine girebilmesi ve oluşan ürün tercihen kültür ortamına salınabilmelidir. Kültürdeki hücrelerde substratın ürüne dönüşümü için gerekn enzimler bulunmalıdır. Ürünün oluşumu, yıkımından (metabolize olmasından) daha hızlı olmalıdır

Tablo 22. Endüstride kullanılma potansiyeli olan bazı bitki hücre kültürü ürünleri (Scragg, 1991). Metabolit Kültürü yapılan bitki Kullanım Alanı Maliyet($/kg) Aymalisin Catharanthus roseus İlaç sanayi 1500 Kodein Papaver somiferum 650 Digoksin Digitalis lanata 3000 Yasemin Jasminum türleri Parfümeri 5000 Kinin Cinchona ledgeriana İlaç ve gıda sanayi 100 Gül yağı Rosa spp. Kozmetik 300 Şikonin Lithospermum erythrorhizon İlaç ve boya sanayileri 4500

Özetle bitki hücre kültürleri ile biyodönüşüm, tıpkı mikroorganizmalarda fermentasyon tekniğinde olduğu gibi endüstriyel açıdan yararlı bir sistem olabilir. Biyodönüşüm sadece bilinen metabolitlerin hızlı ve etkin bir şekilde sentezlenmesi için değil aynı zamanda daha önce bitkilerde varlığı bilinmeyen yeni kimyasalların ortaya çıkmasında da katkıda bulunabilir. Yine yukarıda belirtildiği gibi bitki hücre kültürleri ile biyodönüşüm, bazı çevre kirliliğine yol açan bazı kimyasalların (senobiyotiklerin) parçalanma mekanizmalarının araştırılmasında kullanışlı deneysel sistemler olabilir.

Biyoreaktörler (fermentörler) Hücre süspansiyon kültürleri ile sekonder metabolitlerin üretimi konusunda şimdiye kadar verilen pek çok örnek en çok 1 litre kapasiteli, kapalı bir sistemden ibaret kültürlere aitti. Halbuki biyoreaktör veya fermentör adı verilen sistemler ile kapasiteyi birkaç litreden binlerce litreye kadar çıkarmak mümkün olmaktadır. Böylelikle endüstriyel anlamda bitki hücre kültürlerinden yararlanma olanağı gündeme gelmektedir. Bitki hücrelerinin biyoreaktörlerde kültürü yapılmasının iki önemli avantajı vardır.

1. Kültürlerin daha yakın denetimi 1. Kültürlerin daha yakın denetimi. Kapalı bir sistemde kültürü yapılan hücrelerin bulunduğu ortamdaki değişiklikleri denetim altına almak bir hayli zordur. Oysa biyoreaktörlerde gazlar (oksijen ve karbondioksit) pH ve sıcaklık gibi değişken faktörlerin yakın denetimi mümkün olmaktadır. Bu yakın denetim olanağı, biyoreaktörlerin iyi karışan bir sistem olmasını sağlamaktadır. Böylece ürün analizi için gerekli miktarda (örneğin 100ml) ve ortamdaki gerçek durumu temsil edebilen örnekler biyoreaktörden daha kolay alınabilmektedir.

2. Bitki hücre kültürlerinin endüstriyel amaçlı kullanılması için (özellikle ekonomik açıdan önemli metabolitlerin üretiminde) büyük ölçekli kültürler gerekmektedir. Bu kültürler için gerekli ön bilgiler biyoreaktörler ile sağlanmaktadır. Gerek büyüme ve gerekse ürün oluşumu bakımından en yüksek verimin alındığı hücre süspansiyon kültürlerinden büyük ölçekli kültürlerin başlatılması durumunda, kültüre ait pek çok özelliğin değiştiği görülmektedir.

Örneğin, kültürün kuru ağırlık miktarı kültür hacminin kübüyle orantılı olarak değişirken, ürün verimindeki değişim kültür hacminin karesiyle orantılı olmaktadır. Dolayısı ile büyük ölçekli kültürler başlatılmadan önce, gerek büyüme ve gerekse ürün oluşumu için önemli olan parametreler uygun biyoreaktörlerde gözden geçirilmelidir. Bitki hücrelerinin biyoreaktörlerde yüksek hacimde kültür, özellikle ekonomik değeri yüksek, ancak bitkiden izole edilen miktarı düşük kimyasallar için tasarlanmıştır. Örneğin, C. roseus bitkisinden elde edilen ve yapıştırıcı olarak kullanılan kodein ekonomik değeri yüksek maddedir. Ancak bu maddelerin yukarıda adı geçen bitkilerden elde ediliş miktarları çok düşüktür.

Bioreaktörlerin geçen zaman içerinde ihtiyacı karşılayacak şekillde ve kontrollu şartları taşıyabilen örnekleri günümüzde oldukça gelişim göstermiştir. Aşağıda bu özelliklerden bazıları yer almaktadır. Mikroptan arındırılmış (steril) bir ortam olmalı, PH, oksijen, karbondioksit ve sıcaklık gibi çevresel etmenlerin denetimi için giriş noktası, Taze besi ortamı, köpük giderici maddeler, pH’ nın düzenlenmesi için gereken asit veya baz ilavesi için giriş noktası, Hava girişi (sterilite için filtre sistemli) Karıştırma (karıştırıcılı tank sisteminde pervane, hava kaldıraçlı sistemlerde ise doğrudan havanın kendisi). Sıcaklık denetimi için soğutma-ısıtma devresi (içinden soğutma suyu ve buhar geçen borular).

KAYNAK KİTAPLAR Street,H. E. Ed(1973) Botanical monograghs. Vol KAYNAK KİTAPLAR Street,H.E.Ed(1973) Botanical monograghs.Vol.11 Plant tissue and cell culture, University of California press, Berkeley and Los Ageles Gönülşen N., (1987 ) Bitki Doku Kültürleri Yöntemleri ve Uygulama Alanları. TC Tarım Orman ve Köyişleri Bakanlığı Ege Tarımsal Araştırma Enstitüsü Yayın No: 78, Menemen- İzmir Kyte, L.(1987) Plants from test tubes- An introduction to micropropagation Timer Press Oregon Özcan S., Gürel E. Ve Babaoğlu M.,(2001). Bitki biyoteknolojisi 1 ve 2 S.Ü. Vakfı yayınları Konya Her Konu ile ilgili çok sayıda Uluslararası ve Ulusal makalelerden örnekler

Dondurarak saklama ve germplazma depolanması Kurutma yöntemleri. Çözdürme sonrası işlemler ve iyileştirme işlemleri