Biyoteknoloji ve Genetik I Hafta 9 Prokaryotlarda Gen İfadesinin Düzenlenmesi Prof. Dr. Hilal Özdağ A.Ü Biyoteknoloji Enstitüsü Merkez Laboratuvarı Tel: 2225826/125 Eposta: hilalozdag@gmail.com

Gen İfadesi DNA Transkripsiyon RNA Translasyon PROTEİN

Prokaryotik Hücre Nükleoid Bölge Kapsül Flagellum Ribozom Besin Granülü Flagellum Plazmid DNA Sitoplazma Plazma membranı Hücre duvarı Kapsül

Gen İfadesi 20. yy’ın başından beri organizmaların metabolizmalarının nasıl düzenlediğine dair araştırmalar sürmektedir. Sınırlı bilgi ve teknolojinin varlığında başlayan bu araştırmalarda bakteriler en baştan beri (ve bugüne kadar) en iyi model organizmalar olmuştur. Gen ifadesine dair veriler öncelikle biyokimyasal analizlerden elde edilmiştir.

Gen İfadesi 1900’lerin başında bakterilerin ortamda laktoz varken gerekli enzimleri sentezlediğini, ortamda laktoz yokken bu enzimlerin sentezlenmediği tespit edilmiş ve bu durum adaptif (fakültatif) enzim kavramını ortaya çıkarmıştır. Bu enzimlere daha sonraları durumu daha iyi açıkladığı düşünülen indüklenebilir enzimler denmiştir. Sürekli sentezlenen enzimlere ise konstitütif denmektedir.

Gen İfadesi Araştırmalar en önemli sonuçlarını 1946’da Jacques Monod’nun çalışmaları ile vermeye başlıyor. Ardından Joshua Lederberg, François Jacob ve Andre L’woff’un katkıları sürecin deşifre edilmesinde önemli rol oynuyor. Bu araştırmalarla şekillenen operon modelinde aynı süreçte beraber çalışan çalışan enzimleri kodlayan genler (poli sistronik) kümeler halinde organize olur.

Gen İfadesi Bu genler tek bir düzenleyici birim tarafından koordine edilir. Bu düzenleyici bölge düzenledikleri genlerin üst kısımlarında yer alır (cis-acting bölge). Bu bölgenin regülatör işlevi bu bölgeye bağlanan moleküllerin etkisi (trans-acting elements) ile devreye girer.

Operon www.nature.com

Operon

Operon

Gen İfadesi 1900’lerin başında bakterilerin ortamda laktoz varken gerekli enzimleri sentezlediğini, ortamda laktoz yokken bu enzimlerin sentezlenmediği tespit edilmiş ve bu durum adaptif (fakültatif) enzim kavramını ortaya çıkarmıştır. Bu enzimlere daha sonraları durumu daha iyi açıkladığı düşünülen indüklenebilir enzimler denmiştir. Sürekli sentezlenen enzimlere ise konstitütif denmektedir.

PCR ve DNA Dizi Analiz Öncesi Dönemde Araştırma Yaklaşımları Biyokimyasal bulgular Haritalama çalışmaları Mutant suşların oluşturulması ve fonksiyonel sonuçların irdelenmesi Sahte uyarıcıların bulunuşu (laktozun kükürtlü analoğu izopropiltiyogalaktozit_IPTG) ile substrat olmaksızın uyarılma mekanizmasının çalışılmasını sağlamıştır.

PCR ve DNA Dizi Analiz Öncesi Dönemde Araştırma Yaklaşımları Regülatör bölgeler tanımlanırken yine mutantlardan ve haritalamadan yararlanılmıştır. Laktoz ortamda olmasa da enzimlerin sentezlenmesine yol açan mutasyonların bulunduğu bölgelerin (lacI-) yapısal genlerin yakınında ancak farklı bir bölgede olduğu tanımlanmıştır. lacI geni baskılayıcı gen olarak adlandırılır.

PCR ve DNA Dizi Analiz Öncesi Dönemde Araştırma Yaklaşımları Benzer etki gösteren diğer konstitütif mutasyonların yine yapısal genlerin hemen yakınındaki operatör bölgede yer aldığı tespit edilmiştir (lacOc). E. coli hücresinde 10 kopyadan fazla bulunmayan baskılayıcı molekülün izolasyonu kolay olmamıştır. 1966’da Gilbert ve Müller-Hill bu molekülü kısmen saflaştırmış ve dansite gradient çalışması ile DNA’ya bağlandığını da göstermişlerdir. 1996 yılında Lewis, Lu ve ark, baskılayıcı komplekslerin kristal yapılarını açıklayarak operon modelini yapısal olarak doğrulamışlardır.

Lac Operonu wikimedia.org Yüksek ve konstitütif ifade Düşük glukoz Laktoz + Yüksek Laktoz - Düşük bazal seviyede ifade wikimedia.org

Lac Operonu www.nature.com

Klonlamada Pratik Bir Belirteç Mavi Beyaz Seçimi

Klonlamada Pratik Bir Belirteç Mavi Beyaz Seçimi TA Klonlama lacZ geni içinde çoklu klonlama bölgesi ve antibiyotik direnç geni içeren plazmid + PCR Ürünü Plazmidin ligasyon sonrası bakteri hücresine transformasyonu

Triptofan Operonu

Triptofan Operonu http://pathmicro.med.sc.edu/mayer/genreg7.jpg

Triptofan Operonu www.nature.com