Zebra Balığında (Danio rerio) Primer Hepatosit Kültürü ve Toksikolojik Çalışmalarda Kullanılması Burak GÖKÇE, Sema İŞİSAĞ ÜÇÜNCÜ Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Zooloji Anabilim Dalı burak_gokce@yahoo.com GİRİŞ Kirleticilerin toksik etkilerini araştırmak için geleneksel biçimde kullanılan in vivo yöntemler, araştırma materyallerinin kontrollü süreler içerisinde kimyasallara maruz bırakılmasına dayanır. Farklı giriş yollarıyla canlı materyallerin bünyesine alınan kimyasalların önce görünüm ve davranış üzerindeki etkileri gözlenir, deney süreleri bitiminde de hedef doku ve sistemler çıkartılarak histopatolojik değerlendirmeler yapılabilir. Böylece kimyasalların toksikokinetik ve toksikodinamik süreçleri bütünsel bir sistem içerisinde ve istendiğinde karşılaştırmalı olarak belirlenir. Bu uzun, zahmetli ve pahalı çalışma yöntemi, etkiler hakkında oldukça net kanıtlar sunmasına ve bütünsel değerlendirmelere olanak sağlamasına rağmen etik kaygılar taşır ve hayvan hakları çerçevesinde eleştirilir. Çevresel kirliliğin tüm canlıları olumsuz etkilediği gerçeği, ekotoksikolojik deneylerde canlı hayvanların çekincesizce kullanılabileceği anlamına gelmez. Etik yaklaşım, kaçınılmaz laboratuvar deneylerinde kullanılan hayvan sayısını en düşük, hayvanların konforunu ise en yüksek düzeyde tutmayı, bunun da ötesinde mümkün olduğunca hücre ve doku kültürlerinin kullanımını gerektirir. Tüm ekotoksikolojik araştırmalarda temel hedef, moleküler düzeyden ekosistemlere kadar veri birikimini artırarak her düzeyde risk değerlendirmeleri yapabilmektir. Bu genel kavramlar üzerinden gidildiğine, in vitro çalışmalar kirleticilere karşı duyarlılığı hücresel düzeyde ortaya koymakta, etki mekanizmalarının belirlenmesinde net kanıtlar sağlamaktadır. Bu araştırmalar ayrıca biyoişaretleyiciler açısından da önemlidir. Herhangi bir biyolojik organizasyonda, kimyasallar da dahil çeşitli stres faktörlerinin etkisiyle sentezlenen ya da sentez miktarları değişen, genelde artan moleküller özel fizyolojik yanıtlardır ve biyoişaretleyici olarak kullanılabilirler [1]. Sunulan çalışmada, Danio rerio (zebra balığı) örneklerinden iki farklı yöntemle izole edilen hepatositler, farklı şekilde hazırlanmış kaplarda kültive edildi ve önce canlılık parametreleri incelendi. Farklı biyolojik işaretletleyicilerdeki değişimleri belirlemek için hidrojen peroksit (H2O2) ile oksidatif stres indüklendi ve katalaz (CAT) ile glutatyon-S-transferaz (GST) aktiviteleri değerlendirildi. Sitokrom P4501A1 değişimi ise metilkolantren (MN) ile indüklenerek etoksirezorufin–O deetilaz (EROD) analizi ile araştırıldı. MATERYAL VE METOT Ortalama ağırlıkları 1±0,2 gr olan 50 adet ergin erkek zebra balığı önce adaptasyon için 15 gün süreyle, dinlendirilmiş İzmir/Bornova şehir şebeke suyuyla doldurulan beş adet ve 15x25x35 cm boyutlarındaki cam akvaryumlara dağıtıldı. Tüm örnekler 25±2°C sıcaklıktaki suda, kontrollü uzun gün fotoperiyodunda (14 saat aydınlık, 10 saat karanlık) tutuldu ve günde en az iki kez canlı yem (Daphnia sp.) kullanılarak beslendi. Rastgele seçilen örneklerin uyuşturulmasında karaciğeri etkileyebilecek herhangi bir kimyasal madde kullanımından kaçınılarak +4°C sıcaklıktaki su kullanıldı. Anestezi sonrasında vücut yüzeyleri %70 alkol kullanılarak dezenfekte edilen örnekler laminar flow içine alındı. Burada abdominal kaviteden açılan kesi ile çıkartılan karaciğer dokuları hemen100 IU/ml penisilin ile 100 µg/ml streptomisin (Sigma Aldrich) içeren fosfat tamponlu (PBS) (Sigma Aldrich) EDTA (Sigma Aldrich) çözeltisine konuldu ve tartılarak ağırlıkları kaydedildi. Sonraki işlemler aşağıdaki çizelgelerde belirtildiği gibi yürütüldü. MEKANİK PARÇALAMA (MP) PBS-EDTA içerisinde küçük parçalara ayırma 50 µm porlara sahip filtreden geçirme Elde edilen süspansiyonun santrifüjle çöktürülmesi (300 g) Pelletin yıkanması Tekrar çöktürme ve pelletin besiyeri ile (L-15) sulandırılması Hidrojen Peroksit (H2O2) İndüklemesi Hem CAT, hem de GST aktivasyonun belirlenmesi için bütün deneme gruplarına 18 saat süreyle 50, 100 ve 150µM olmak üzere üç farklı konsantrasyonda H2O2 uygulandı. Kontrol gruplarına hiçbir uygulama yapılmadı. Tüm gruplardaki hücre canlılıkları MTT (3-(4,5- dimetiltiazol -2-yl)-2,5-difenil tetrazolyum bromid) testi ile değerlendirildi ve her üç konsantrasyon için de %90’ın altında canlılık gösteren gruplar enzim aktivite değerlendirilmesi için kullanılmadı. CAT Aktivitesi Oksidatif strese verilen yanıtın katalaz aktivitesi ile değerlendirilmesi için 50 mmol/L KH2PO4 içerisinde toplam 20 mg protein içeren taze homojenatlara 20 mmol/L H2O2 eklenerek toplam hacim 1 ml’ye tamamlandı. Reaksiyon karışımının 240 nm dalga boyundaki spektrofotometrik ölçümleri üç tekrarlı olmak üzere yapıldı. Spesifik aktivite ünite/mg protein/dakika cinsinden hesaplandı. GST Aktivitesi H2O2 uygulamasıyla oluşturulan oksidatif stresin GST aktivasyonuyla belirlenmesinde hepatositler hücre kazıyıcı yardımıyla tabandan kaldırıldı, homojenizasyon tamponu (Sigma-Aldrich) ile süspanse ve 1 dakika sonikasyonla (Sartorius Labsonic M) homojenize edildi. 700g devirde 10 dakika santrifüjle elde edilen süpernatant 9000g devirde 15 dakika santrifüjlendi. Son süpernatantın 105.000g devirde 60 dakika santrifüjlenmesiyle sağlanan mikrozomal pellet; 0,3 mmol/L EDTA ve 0,25 mol/L sukroz içeren 0,05 mol/L potasyum fosfat tamponuyla (pH:7,4) süspansiyonundan sonra ~ 0,3-1 mg protein içeren mikrozomal homojenata 5 mmol/L glutatyon ve 1 mmol/L 1-kloro-2,4-dinitrobenzen eklenip reaksiyon karışımı elde edildi. Örneklerin 340 nm dalga boyundaki absorbansları 4 dakikalık periyotlarda spektrofotometre ile (Agilent Cary 60, uv-vis) ölçüldü. Spesifik aktivite, mg cinsinden protein miktarında dakika başına oluşan değişiklik olarak belirtildi. Ölçümler üç tekrarlı yapıldı. Jelatin Kaplama Flask Mekanik Parçalama (MPJ) Enzimatik Parçalama(EPJ) ENZİM ANALİZLERİ ENZİM İNDÜKLEMELERİ EKİM KARACİĞER DOKUSU ENZİMATİK PARÇALAMA (EP) PBS-EDTA içerisinde küçük parçalara ayırma Tripsin-EDTA (%0,25) Elde edilen süspansiyonun santrifüjle çöktürülmesi (300 g) Pelletin yıkanması Tekrar çöktürme ve pelletin L-15 ile sulandırılması EROD Aktivitesi MN ile indüklenen EROD aktivasyonunda değişimleri belirlemek amacıylaGST aktivitesinde sağlanan mikrozomal homojenatlar kullanıldı. Kültür kabından kazıyıcıyla kaldırılan hücreler 300 g’de 10 dakika süreyle (Ependorf, 5424 R) santrifüjlendi, elde edilen pellet 300 µl homojenizasyon tamponu (Tris-HCl) ile sulandırılıp sonikatörde 30 saniye homojenize edildi. Aktivite ölçümünde homojenatın 10 dakika süreyle 10.000g devirde santrifüjlenmesiyle sağlanan süpernatant kullanıldı. Ölçümler üç tekrarlı yapıldı. Düz Flask Mekanik Parçalama (MPD) Enzimatik Parçalama (EPD 3-metilkolantren (MN) İndüklemesi Deneme gruplarına 12 saat süreyle 100, 250 ve 500 nM metilkolantren uygulandı, kontrol grubuna uygulama yapılmadı. Tüm gruplarda hücre canlılığı MTT testi ile belirlendi ve uygulama sonrasında %90’ın altında canlılık gösteren gruplar enzim değerlendirilmeleri için kullanılmadı. Stok solüsyon MTT (Sigma Aldrich) kristallerinin PBS içerisinde 5mg/ml konsantrasyonda olmak üzere çözülerek 0,20 µm por çapındaki filtre ile sterilize edilmesiyle hazırlandı. Kuyucuk içerisindeki her 100 µl besiyere 10 µl stok solüsyon eklendi ve 27°C sıcaklıkta 4 saat inkubasyon sonrasında oluşan formazan kristallerinin çözülmesi için 0,04N asit-izopropanol çözeltisi kullanıldı ve pipetaj yapıldı. Plakaların 570 nm dalga boyundaki absorbansları spektrofotometre (Thermo Varioskan) ile ölçüldü. İSTATİSTİKSEL DEĞERLENDİRME Veriler tek yönlü varyans analizi yöntemiyle (ANOVA) ve IBM SPSS V.20 programı kullanılarak değerlendirildi BULGULAR Hücre Canlılıkları GST Aktiviteleri Mekanik parçalamayla sağlanan kültürlerde hücre yoğunluğu ve canlılığı enzimatik parçalanmayla sağlanan gruba göre daha düşüktü (Şekil 1, Tablo 1) ve düz-jelatinli kuyucuk uygulamasının bu parametreler üzerinde herhangi bir etkisi yoktu (Şekil 1). İndükleme amacıyla kullanılan H2O2 ve MN konsantrasyonları ve uygulama süresi arttıkça CAT (Tablo 2-5); GST (Tablo 6-9) ve EROD (Tablo 10-13) aktivasyonları tüm denenme gruplarında yükseldi. En düşük artış kontrole göre yaklaşık iki kat olarak CAT aktivasyonunda (Tablo 2-5); en çarpıcı artış ise kontrole göre yaklaşık sekiz kat olarak EROD aktivasyonunda (Tablo 10-13) izlendi. İstatistiksel analizler, aktivasyon değişimlerinin tüm gruplarda anlamlı olduğunu gösterdi (Tablo 14). Mekanik-enzimatik parçalama yöntemlerinin CAT, GST ve EROD aktivitesi üzerindeki etkileri tek yönlü varyans analizi ile değerlendirildiğinde ise gruplar arasındaki farkın istatistiksel olarak anlamlı olmadığı ve düz-jelatinli kuyucuk uygulamasının enzim aktiviteleri üzerinde de etkisinin bulunmadığı izlendi (Tablo 15). GRUPLAR H2O2 KONS. (µM) MPD-GST AKTİVİTESİ (U/mg protein) 3. gün 5. gün 7. gün Kontrol - 2,24±0,01 2,27±0,02 2,34±0,01 MPD 1 50 3,54±0,01 3,58±0,07 3,59±0,08 MPD 2 100 5,27±0,04 5,32±0,04 5,34±0,01 MPD 3 150 7,45±0,1 7,61±0,1 7,69±0,07 GRUPLAR H2O2 KONS. (µM) MPJ-GST AKTİVİTESİ (U/mg protein) 3. gün 5. gün 7. gün Kontrol - 2,24±0,05 2,29±0,005 2,33±0,04 MPJ 1 50 3,5±0,04 3,56±0,01 3,58±0,02 MPJ 2 100 5,19±0,03 5,27±0,01 5,38±0,01 MPJ 3 150 7,35±0,008 7,68±0,01 7,75±0,04 Şekil 1. MP ve EP yöntemiyle hazırlanıp düz ve jelatinli kuyucuklara ekilen kültürlerde hücre canlılık ve yoğunlukları Tablo 6. MPD grubunda GST değişimleri Tablo 7. MPJ grubunda GST değişimleri GRUPLAR HÜCRE YOĞUNLUĞU (hücre/ml/gr karaciğer) HÜCRE CANLILIĞI (%)   MP 2,1x107 92,627 EP 3,6x107 96,327 GRUPLAR H2O2 KONS. (µM) EPD-GST AKTİVİTESİ (U/mg protein) 3. gün 5. gün 7. gün Kontrol - 2,26±0,01 2,31±0,02 2,34±0,01 EPD 1 50 3,47±0,01 3,58±0,01 3,6±0,01 EPD 2 100 5,24±0,01 5,32±0,01 5,37±0,01 EPD 3 150 7,45±0,010 7,61±0,01 7,69±0,01 GRUPLAR H2O2 KONS. (µM) EPJ-GST AKTİVİTESİ (U/mg protein) 3. gün 5. gün 7. gün Kontrol - 2,27±0,01 2,31±0,03 2,34±0,02 EPJ 1 50 3,57±0,01 3,61±0,03 3,65±0,02 EPJ 2 100 5,27±0,01 5,37±0,01 5,4±0,03 EPJ 3 150 7,32±0,01 7,47±0,01 7,61±0,03 Tablo 1. MP ve EP yöntemiyle hazırlanan kültürlerde hücre canlılık ve yoğunlukları Tablo 8. EPD grubunda GST değişimleri Tablo 9. EPJ grubunda GST değişimleri CAT Aktiviteleri EROD Aktiviteleri GRUPLAR H2O2 KONS. (µM) MPD - CAT AKTİVİTESİ (U/mg protein) 3. gün 5. gün 7. gün Kontrol - 32,14±0,1 32,21±0,1 33,43±0,1 MPD 1 50 42,34±0,1 43,57±0,3 43,87±0,1 MPD 2 100 54,43±0, 54,87±0,4 55,021±0,4 MPD 3 150 59,64±0,6 60,21±0,4 61±0,1 GRUPLAR H2O2 KONS. (µM) MPJ- CAT AKTİVİTESİ (U/mg protein) 3. gün 5. gün 7. gün Kontrol - 31,89±0,5 32,15±0,2 32,93±0,4 MPJ 1 50 41,94±0,1 42,57±0,5 43,17±0,3 MPJ 2 100 53,83±0,4 54,27±0,2 54,92±0,1 MPJ 3 150 59,84±0,3 61,01±0,4 61,43±0,07 GRUPLAR MN KONS.(nM) MPD-EROD AKTİVİTESİ (pmol/min/mg protein) 3. gün 5. gün 7. gün Kontrol - 176,478±0,45 177,328±0,41 177,536±0,80 MPD 1 100 270,244±0,69 274,32±0,70 273,57±0,38 MPD 2 250 578,017±0,48 580,305±0,34 583,45±0,84 MPD 3 500 793,2657±0,35 796,278±0,43 801,354±0,27 GRUPLAR MN KONS.(nM) MPJ-EROD AKTİVİTESİ (pmol/min/mg protein) 3. gün 5. gün 7. gün Kontrol - 176,359±0,45 176,982±0,16 177,432±0,26 MPJ 1 100 279,244±0,14 280,201±0,28 281,67±0,37 MPJ 2 250 592,6837±0,37 593,89±0,29 594,65±0,18 MPJ 3 500 820,9323±0,72 821,205±0,38 822,65±0,22 Tablo 2. MPD grubu CAT değişimleri Tablo 3. MPJ grubunda CAT değişimleri Tablo 10. MPD grubunda EROD değişimleri Tablo11. MPJ grubunda EROD değişimleri GRUPLAR H2O2 KONS.(µM) EPD-CAT AKTİVİTESİ (U/mg protein) 3. gün 5. gün 7. gün Kontrol - 31,26±0,1 31,65±0,2 32,03±0,1 EPD 1 50 41,04±0,4 41,47±0,2 41,93±0,03 EPD 2 100 52,83±0,1 53,17±0,2 53,96±0,5 EPD 3 150 59,54±0,8 60,41±0,1 61,03±0,4 GRUPLAR H2O2 KONS. (µM) EPJ-CAT AKTİVİTESİ (U/mg protein) 3. gün 5. gün 7. gün Kontrol - 31,56±0,1 31,95±0,2 32,18±0,3 EPJ 1 50 41,21±0,2 41,97±0,1 42,37±0,3 EPJ 2 100 52,63±0,07 53,67±0,3 54,06±0,4 EPJ 3 150 58,94±0,1 59,81±0,2 60,37±0,1 GRUPLAR MN KONS.(nM) EPD- EROD AKTİVİTESİ (pmol/min/mg protein) 3. gün 5. gün 7. gün Kontrol - 176,169±0,43 176,581±0,37 177,298±0,29 EPD 1 100 269,5773±0,22 270,209±0,36 272,65±0,19 EPD 2 250 591,017±0,48 592,39±0,29 592,906±0,42 EPD 3 500 795,599±0,30 796,102±0,36 796,95±0,10 GRUPLAR MN KONS.(nM) EPJ-EROD AKTİVİTESİ (pmol/min/mg protein) 3. gün 5. gün 7. gün Kontrol - 177,008±0,65 177,598±0,16 177,945±0,81 EPJ 1 100 277,244±0,41 277,98±0,30 278,43±0,18 EPJ 2 250 591,3503±0,30 592,305±0,32 593,207±0,37 EPJ 3 500 798,9323±0,96 790,102±0,86 791,69±0,50 Tablo 4. EPD grubunda CAT değişimleri Tablo 5. EPJ grubunda CAT değişimleri Tablo 12. EPD grubunda EROD değişimleri Tablo 13. EPJ grubunda EROD değişimleri CAT GST EROD MP EP MPD MPJ EPD EPJ Gruplar Arası Kareler Toplamı 914,2 927,7 907,9 881,2 26,5 22,72 15,51 22,68 313338 338955 318791 319635 Serbestlik Derecesi 1 Ortalama Kareler F 19,22 17,95 17,03 18,36 13,1 9,156 3,232 10,11 7,504 7,644 7,582 7,91 P 0,001 0,002 0,01 0,013 0,012 0,010 0,021 0,02 0,018 Gruplar İçi 475,6 516,8 533,1 479,9 20,3 24,81 48 22,44 417553 443410 420464 404102 10 47,56 51,68 53,31 47,99 2,03 2,481 4,8 2,244 41755 44341 42046,4 40410  - - -  Toplam 1390 1445 1441 1361 46,8 47,54 63,52 45,12 730891 782365 739256 723737 11 ortalama kareler CAT GST EROD MPD-MPJ EPD-EPJ MP-EP Gruplar Arası Kareler Toplamı 0,186 8,3 0,652 1,508 1,047 784,804 4,214 96,869 Serbestlik Derecesi 1 2 Ortalama Kareler 326 0,754 2,107 F 0,001 0,068 0,073 0,146 0,236 0,011 P 0,97 0,999 0,796 0,93 0,865 0,63 0,916 0,969 Gruplar İçi 2834,329 2802,16 5636,7 93,818 108,174 204,15 1513255,9 1462998 2977043 22 46 21 128,833 127,371 122,54 4,468 5,151 4,438 68784,358 69666,6 64718,326 -  - Toplam 2834,514 5645 94,47 109,682 205,2 1514040,7 1463002 2977139,9 23 47 İstatistiksel Değerlendirmeler Tablo 15. Enzim aktivitelerinin gruplar arası değerlendirilmesi Tablo 14. Enzim aktivitelerinin gruplar içi değerlendirilmesi SONUÇ Mekanik parçalamayla sağlanan kültürlerde hücre yoğunluğu ile canlılığının, enzimatik parçalanmayla sağlanan gruba göre daha düşük olması önceki raporlara uygundu [2-9]. Bu bulguya rağmen MP ve EP yöntemiyle hazırlanan kültürlerde enzim aktivasyonları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlenmemesi, EP yönteminin başka enzimler kullanılarak ya da uygulanan tripsin konsantrasyonu değiştirilerek modifiye edilebileceğini akla getirdi [9]. Hücrelere tutunabilecekleri bir matriks oluşturma amacıyla kolay temin edilen, ucuz bir malzeme olarak denenen jelatin yerine, önceki yayınlarda belirtildiği gibi [3, 8] kollajen ve hyaluronan gibi materyallerin kullanımının daha uygun olacağı sonucuna varıldı. Mevcut verilere göre D. rerio primer hepatosit kültürlerinde çevresel stresi en kolay belirleyecek biyobelirtecin EROD olabileceği düşünüldü. Primer kültürlerin kimyasal maddelere verilecek yanıtları belirlemek için kullanımına getirilen esas eleştiri, sistem ve vücut bütünlüğünden ayrıştırılmış yapıların gerçek tepkileri ne kadar yansıttıklarıdır. Ancak in vitro çalışmaların bu eleştiriye rağmen giderek çok daha yaygın hale gelmesi kaçınılmazdır. Sunulan araştırma bu konuda ülkemiz için bir ilktir ve genişletilerek sürdürülmektedir. KAYNAKLAR 1. Lagadic, L., 2002, Biomarkers: useful tools for the monitoring of aquatic environments, Revue De Medecine Veterinaire, 153: 581–588. 2. Bouche, G., Gas, N., Paris, H., 1979, Isolation of carp hepatocytes by centrifugation on a discontinuous Ficoll gradient: A biochemical and ultrastructural study, Biology of the Cell, 36:17–29 pp. 3. Seibert, H., 1985, Viability control and oxygen consumption of isolated hepatocytes from thermally acclimated rainbow trout (Salmo gairdneri). Comperative Biochemistry and Physiology, 81(B):877–83 pp. 4. Hyllner, S.J., Andersson, T., Haux, C., Olsson, P.E., 1989, Cortisol induction of metallothionein in primary culture of rainbow trout hepatocytes. Journal of Cell Physiology, 139(1):24-28 pp. 5. Kennedy, C.J., Gill, K.A., Walsh, P.C., 1991, Temperature acclimatisation of xenobiotic metabolising enzymes in cultured hepatocytes and whole liver of the gulf toadfish (Opsanus beta), Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 48:1212–1219 pp. 6. Mommsen, T.P., Danulat, E., Gavioli, M.E., Foster, D.G., Moon, T.W., 1991, Separation of enzymatically distinct populations of trout hepatocytes, Canadian Journal of Zoology, 69:420–426 pp. 7. Skett P., 1994, Problems in using isolated and cultured hepatocytes for xenobiotic metabolism:metabolism-based toxicity testing-solutions, Toxicol. in vitro, 8:491–504. 8. Segner, H., 1998, Isolation and primary culture of teleost hepatocytes, Comperative Biochemistry and Physiology, Part A, 120:71–81 pp. 9. Yanhong, F., Chenghua, H., Guofang, L., Haibin, Z., 2008, Optimization of the isolation and cultivation of Cyprinus carpio primary hepatocytes, Cytotechnology, 58:85–92.