PROTEİN TAYİN YÖNTEMLERİ BRADFORD YÖNTEMİ Özlem ÖZDEMİR

Proteinlerin Kantitatif Olarak Tayini Molekül konsantrasyonu ışık absorbsiyonu Beer kanununa göre eğer çözünen bir madde belirli bir dalga boyunda ışık absorbluyorsa, bu absorbsiyon o maddenin çözeltideki miktarı ile doğru orantılıdır. Spektrofotometre cihazı yardımı ile bu absorbsiyon ölçülebilir. Ancak genellikle incelenen madde kendi başına analiz yapılmasına yeterli olacak miktarda absorbsiyon yapamaz. İşte bu durumda incelenecek maddeye bağlanabilecek renkli bileşenler bağlanır ve ölçüm yapılır.

Standart Eğri Standart eğri hazırlanması Belirli konsantrasyonlarda saf protein içeren çözeltiler kullanılır. Her konsantrasyona karşılık gelen absorbanslar hesaplanır ve grafik üzerinde yerleştirilir. Elde edilen noktalara göre en uygun lineer grafik çizilir. Konsantrasyonu bilinmeyen protein çözeltisinin verdiği absorbans bu eğri üzerinde yerine konularak konsantrasyon hesaplanır. En yaygın kullanılan protein standartı sığır serum albuminidir (BSA)

Bir çözeltideki total protein miktarının belirlenmesi, Ayırma ve saflaştırma işlemlerinin seçiminde Belli aşamalardaki protein veriminin ve saflığının kontrolünde Elektroforetik ve kromotografik ayırmalarda deneylerin optimizasyonunda

Bradford Yöntemi Bir örnekteki total protein konsantrasyonunu belirlemede kullanılan boya bağlama esaslı bir yöntemdir. Çok sık kullanılan kolay bir methoddur. Ucuz ve hızlı Yüksek spesifite gösterir. Oldukça duyarlı (5-100 µg/m)

Bradford yöntemi Coomasie brillant blue G-250 boyasının farklı konsantrasyonlardaki proteinlere bağlanarak, değişik renk şiddetinde mavi renkli çözeltiler ortaya koymasından yararlanılarak geliştirilmiştir. Arginine Tyrosine Tryptophan Histidine phenylalanine Mavi kompleks Coomasie brillant blue G-250

Mavi rengin oluşmasında proteinin aminoasit bileşimi önemlidir. bazik amino asitlere (arjinin,histidin) aromatik amino asitlere (tirozin, triptofan,fenilalanin) Yöntemde boyaya bağlanmış protein 595 nm dalga boyunda maksimum absorbans verir.

Method Standart solüsyonlar hazırlanır. Örnekler eğer gerekiyorsa dilute edilir. 96 well plate’ de her kuyucuğa 90 ml Bradford solüsyonu konulur. Blank (kör) için kuyucuğa 10 ml su eklenir.3 tekrarlı yapılır. Standart solüsyonlardan 10 ml kuyucuklara eklenir. 3 tekrarlı yapılır. Konsantrasyonu hesaplanacak örneklerden 10 ml kuyucuklara eklenir.3 tekrarlı yapılır. 595 nm’de absorbans ölçülür. Standart eğride yerine koyularak konsantrasyonlar hesaplanır.